Moss Verimli Polietilen Glikol (PEG) aracılığı ile Dönüşüm Physcomitrella Dini ayinlerde kullanılan patenler

Bu prosedürün genel amacı SCO Metre protoplastlarını transforme etmektir. Bu işlem, öncelikle bitkilerin Drizly ile sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, protoplastlar drizly'yi uzaklaştırmak için mannitol ile yıkanır ve daha sonra DNA ve peg ile inkübe edilir.

Son olarak, transforme edilmiş protoplastlar plakalara yayılır ve inkübe edilir. Nihayetinde, floresan mikroskopisi aracılığıyla floresanla işaretlenmiş proteinleri eksprese eden transforme olmuş protoplastları gösteren sonuçlar elde edilebilir. Prosedürü laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Y lu uygulamalı olarak gösterecektir.

Bu tekniğin temel avantajı, etkili olması ve ilgilenilen proteini eksprese eden protoplastları tutarlı bir şekilde üretmesidir. Yosun protoplastlarını izole etmek için, bir spatula kullanarak bir Petri kabına dokuz mililitre %8 mannitol ekleyerek başlayın. İki ila üç PP NH dört plaklarından alınan beş ila yedi günlük yosunları mannitol içine yerleştirin. Bunun ve ek reaktif tarifleri için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Ardından, üç mililitre %2 drizly ekleyin ve oda sıcaklığında, hafifçe çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin.

Yeşil homojen bir süspansiyon elde etmek için karışımı 100 mikronluk elekten süzün. Ardından filtratı 250 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çok nazikçe uzaklaştırın.

Protoplastları 500 µL %8 mannitol içinde yeniden süspanse edin. Ardından, 9,5 mL daha %8 mannitol ekleyin. Protoplastların tamamen süspanse olduğundan emin olun.

Çözeltiyi beş dakika boyunca 250 G'de tekrar döndürerek yıkama adımlarını iki kez daha gerçekleştirin. Süpernatantı atın ve protoplastları önce 500 µL içinde yeniden süspande edin.

Ardından, bir hemositometre kullanarak %8 mannitolin 9,5 mililitresini ekleyin. İzole edilen protoplastlara DNA transformasyonu yapmak için süspansiyonun 10 mikrolitresindeki protoplast sayısını sayın. İlk olarak, protoplast karışımını 250 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve protoplastları MMG çözeltisi içinde mililitrede 1,6 milyon olacak şekilde yeniden süspande edin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Ardından, 60 µg DNA içeren bir kültür tüpüne 600 µL protoplast çözeltisi ekleyin. Çalkalayın.

700 µL PEG kalsiyum çözeltisini nazikçe ekleyin ve çalkalayın. Bu bekleme süresi boyunca numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca iyice inkübe edin. PRMB plakalarının üzerini selofan ile kapatın.

Ardından süspansiyonu üç mililitre W 5 çözeltisi ile seyreltip 250 G'de beş dakika boyunca santrifüj edin. PEG'i uzaklaştırmak için protoplastları iki mililitre PRM tamponunda yeniden süspande edin, her bir PRMB plağına bir mililitre olacak şekilde ekleyin ve plakları selofanla örtün. Plakları bir büyüme odasında 25 °C'de tutun.

Son olarak, transformasyondan dört gün sonra, selofan tabakasını taze seleksiyon plaklarına aktarın. Bu şekil, higromisin direnç kaseti taşıyan 15 µg süper kıvrımlı plazmid DNA ile transforme edilmiş protoplastlardan rejenerasyonu gerçekleştirilen 18 günlük bitkilerin bir örneğini göstermektedir. Burada, aynı süper kıvrımlı plazmid DNA'dan 30 µg protoplastlara transforme edilmiştir.

Bu örnekte 60 µg plazmid DNA transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Son olarak, bu bitkiler, higromisin direnç kasetini taşıyan aynı süper kıvrımlı plazmid DNA'nın 120 µg'ı ile transforme edilmiş protoplastlardan rejenerasyon yoluyla üretilmiştir. Transformasyon verimliliği, 60 µg'a kadar olan DNA konsantrasyonlarından etkilenmemektedir.

Buna karşın, daha yüksek DNA konsantrasyonları bu prosedür için sakıncalıdır. Veriler, bu yöntemin geniş bir DNA miktarı aralığında tutarlı sonuçlar verdiğini göstermektedir. Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında üç saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, gen fonksiyonuna ilişkin ek soruları yanıtlamak amacıyla geçici RNAi ve gen nakavtları gibi ek yöntemler uygulanabilir.