Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki değişimleri izlemektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin mitokondriyal matrikse hedeflenen rasyometrik kalsiyum indikatör proteini peram ile transfekte edilmesi ve ardından transfeksiyondan bir veya iki gün sonra işlem yapılmasıyla gerçekleştirilir. Floresan mikroskobu ve yazılımı, canlı hücre görüntüleme için hazırlanır.

Kalsiyum mobilize eden bir agonist eklendikten sonra, rasyometrik peram eksprese eden hücrelerin görüntüleri elde edilir. Prosedürün son adımı, elde edilen görüntülerin kantitatif analizidir. Nihayetinde, rasyometrik bir kalsiyum indikatör proteini eksprese eden canlı hücrelerin floresan mikroskopisi aracılığıyla, mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki dinamik değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, sentetik kalsiyum indikatörleri kullanılarak kalsiyum seviyelerinin ölçülmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ratiometrik peram'ın genetik olarak kodlanmış olması ve bu sayede mitokondriye veya ilgilenilen diğer herhangi bir organele yönlendirilebilmesidir. Merhaba, ben Dr. Benning'in laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı Dr. Ascar; bugün prosedürü uygulamalı olarak göstereceğim. Protokole başlamak için, bir gece önceden HeLa hücrelerini, ertesi günkü transfeksiyon sırasında yaklaşık %70 konfluen olacak bir yoğunlukta, standart altı kuyucuklu bir kültür plağına yerleştirilmiş steril cam lameller üzerine ekiniz. Ertesi gün, transfekte edilecek her bir kuyucuk için 4 µg ratiometrik peram mitokondriyal ekspresyon vektörü ve 0,5 mL Opti-MEM içinde seyreltilmiş 10 µL Lipofectamine 2000 kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA-Lipofectamine 2000 komplekslerini hazırlayın.

Ardından, her kuyuktaki D-M-E-M-F-B-S HELOC kültür ortamını 1,5 mililitre antibiyotiksiz aynı ortam ile değiştirin. Kompleksler oluştuktan sonra LIPECTOMY solüsyonunu DNA solüsyonuna ekleyin ve nazikçe karıştırın. DNA Lipectomy solüsyonunu, plak hafifçe sallanarak karıştırılıp transfekte edilecek her kuyuca damla damla ekleyin ve inkübasyonu takiben 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir hücre kültürü inkübatöründe dört saat boyunca inkübe edin.

Besiyerini, antibiyotik içeren D-M-E-M-F-B-S ile değiştirin. Görüntüleme yapmadan önce hücrelerin bir ila iki gün boyunca metric peram ekspres etmesine izin verin. HELOC hücreleri içeren lamelini, bir penset yardımıyla görüntüleme solüsyonu bulunan uygun bir görüntüleme haznesine nazikçe yerleştirin.

Görüntüleme haznesini ters bir mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, 40 x veya daha yüksek büyütmeli bir yağ daldırma objektif ve 380 nanometre dalga boyu kullanın. Rasyometrik peram eksprese eden bir veya daha fazla hücre içeren bir ilgi alanı bulmak için, hücrelerin rasyometrik olduğunu tanımlamak amacıyla burada 380 nanometre kullanılır.

Peram bu dalga boyunda fotobleşinge karşı daha az dirençlidir. İlgi alanı belirlendikten sonra, yazılımı 495 ve 380 nanometrede çift eksitasyon yapacak şekilde ayarlayın. Ardından, sırasıyla 495 ve 380 nanometrede dönüşümlü olarak eksitasyon yaparak görüntüleri elde edin.

Agonist uygulamasından önce, en az 30 saniye boyunca bazal kalsiyum seviyelerinin görüntülerini edinin. Ardından, kalsiyum mobilize edici agonisti bir perfüzyon aparatı aracılığıyla uygulayın ve her bir agonist maruziyet süresi için ekleme zamanını not edin; fotobeyazlamayı önlerken yeterli zamansal çözünürlüğe izin verecek şekilde edinim aralıkları optimize edilmelidir. Deney tamamlandığında, görüntüler çevrimdışı olarak analiz edilebilir.

Analize başlamak için, gerekirse arka plan floresansını çıkarmak amacıyla görüntü alanındaki boş bir bölgeden bir ilgi alanı seçin. Ardından, ilgi alanından elde edilen 4 95 3 80 oran ölçümlerini Excel'e veya benzeri bir grafik yazılımına aktarın. Bu görüntü paneli, oranlı peram ve mitokondriyaların hücre altı lokalizasyonunu göstermektedir.

Solda, ratiometrik PerCAM eksprese eden HeLa hücrelerinin canlı hücre görüntüsü yer almaktadır. Ortada, mitokondriyaların floresan boyaması ve seçici boya MitoTracker Red CMXRos bulunmaktadır. Ve son olarak sağda, burada gösterilen birleştirilmiş görüntü, mitokondrilerinde ratiometrik PerCAM eksprese eden ve 10 µM ATP ilele işlem görmüş dört HeLa hücresinin 495 ve 380 nm rasyo görüntülerinden oluşan bir pseudorenk serisidir; bu dört hücrenin mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki değişimlerin kantifikasyonu ise, mitokondrilerinde ratiometrik PerCAM eksprese eden bir HeLa hücresinin bu görüntüsünde gösterilmiştir.

0.5 µM storsporin uygulamasının 60. dakikasında, tekil mitokondrilerdeki kalsiyum yanıtının heterojenliği ve mitokondrilerin belirgin fragmantasyonu görülmektedir. Beyaz okla gösterilen bazı mitokondrilerde kalsiyumda salınımlı artışlar görülürken, sarı okla gösterilen diğerlerinde kalsiyum seviyesinde belirgin bir değişim görülmemektedir. Bu grafik, 0.5 µM storsporin ile 120 dakika boyunca apoptoz indüksiyonu sonrası tek bir HeLa hücresindeki global mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki değişimi ortaya koymaktadır.

Bu videoyu izledikten sonra, seçici olarak mitokondriyal matrikse hedeflenen kalsiyum mediyasyonlu protein R geometrik peram kullanarak, çeşitli uyaranlara yanıt olarak mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki dinamik değişimlerin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.