Nöron Soma ve Aksonlar compartmentalization mikroakışkan Aygıt Fabrikasyon

Dr. Newly John'ın laboratuvarına hoş geldiniz. John Laboratuvarı, biyolojik uygulamalar için mikroakışkan platformların mühendisliği konusunda uzmanlaşmıştır. Bu videoda, primer nöronların bölmelere ayırılması ve kültürlenmesi için tasarlanmış bir mikroakışkan cihazın üretimini ve kullanımını göstereceğiz.

Nöron cihazı ilk kez Ağustos 2005'te Nature Methods'ta yayınlanmıştır. Tanıtıldığı günden bu yana nöron cihazı, dünyanın dört bir yanındaki iş birlikçileri tarafından yaygın olarak kullanılmıştır. Nöron cihazı, fotolitografi ile önceden oluşturulmuş cihazın bir SUA desenini içeren bir silikon gofret üzerine dökülmüş bir PDMS parçasından oluşur.

Cihaz üç ana özelliğe sahiptir: sekiz milimetre çapında dört rezervuar; her biri 1,5 milimetre genişliğinde, yedi milimetre uzunluğunda ve yüz mikron yüksekliğinde iki ana kanal ve iki ana kanalı birbirine bağlayan, 10 mikrometre genişliğinde ve üç mikrometre yüksekliğinde mikro oluklar. Mikro olukların uzunluğu 150 mikron ile 900 mikron arasında değişebilse de, standart tercih edilen uzunluk 450 mikrondur. Cihaz, ana kanallar ve mikro oluklar dikey olacak şekilde gözlemlendiğinde, olukların solundaki rezervuarların ana kanallar aracılığıyla birbirine bağlı olduğu, sağdaki rezervuarlar için de durumun aynı olduğu görülmektedir.

Bu özellik, hücrelerin yüklenmesini ve medyumun değiştirilmesini mümkün kılan önemli bir özellik olan sıvının ana kanal boyunca akmasını sağlar. Nöron cihazının, geleneksel doku kültürü platformlarına göre üç temel avantajı vardır. Birincisi, hücre gövdelerinin (soma) ve aksonların bölmelere ayrılmasına olanak tanır; nöron cihazı ile saf aksonal fraksiyonlar elde etmek mümkündür.

Mikro olukların boyutu ve uzunluğu, testere gövdelerinin karşıya geçmesini önlerken aksonların diğer ana kanaldan geçmesine olanak tanır. İkinci olarak, cihazın tasarımı sayesinde ve hidrostatik basınçtan yararlanarak, cihazın hacmini ve rezervuarlarını bir tarafta diğerine göre daha yüksek tutarak cihazın hücre tarafına ve/veya akson tarafına ayrı ayrı işlemler uygulanması mümkündür. Ve üçüncüsü, cihazın saf aksonal fraksiyonu vakumlu emişle kesilebilir, böylece araştırmacının aksonal rejenerasyonu incelemesine ve gözlemlemesine imkan sağlanır.

Araştırmacı Hina Lee şimdi mikroakışkan nöron cihazının hazırlanışını gösterecek. Polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan kalıbı dökmek için fotolitografi ile SU-8'den oluşturulmuş bir desene sahip 3 Ang silikon göfer kullanılır. SU-8 desenli silikon göfere ana kalıplar veya kısaca masterlar diyoruz.

PDMS, 10'a bir ağırlık oranında kürleme ajanı ile karıştırılır. Örneğin, 1,5 gram kürleme ajanı başına 15 gram PDMS kullanılır. Ardından PDMS iyice karıştırılır ve silikon gofret üzerine dökülür.

Silikon gofret, 10 santimetrelik bir polistiren Petri kabı içerisindedir. MA'ları yaklaşık dört milimetre kalınlığında kaplamak için yaklaşık 12 gram ile 15 gram arasında PDMS kullanılır. Ardından, PDMS içeren kalıp, Petri kabının kapağı açık bir şekilde vakumlu desikatöre yerleştirilir ve vakum uygulanır.

Bu işlem, kürleme ajanının karıştırılması sırasında PDMS'e giren hava kabarcıklarının giderilmesine yardımcı olmak için yapılır. Hava kabarcıklarının temizlenmesi yaklaşık 15 dakika sürer. PDMS içeren master, vakumlu desikatörde 15 dakika bekledikten sonra dışarı çıkarılır.

PDMS kalıpta hâlâ birkaç hava kabarcığı bulunmaktadır. Kalan tüm kabarcıkları gidermek için 0,45 mikron filtreli bir hava tabancası kullanılır. Ardından kalıp, kürlenmesi için bir saat boyunca 80 derecelik bir sıcak plakaya yerleştirilir.

Vakumlu bir desikatör mevcut değilse, karışım birkaç saat boyunca oda sıcaklığında bırakılabilir. Hava kabarcıkları zamanla kendiliğinden yok olacaktır. Isıtıcı tabla mevcut değilse, PDMS 24 saat sonra oda sıcaklığında kürlenecektir.

Kürleşme işlemi sırasında kalıbın düz olduğundan emin olmak önemlidir. PDMS kalıpta kürleştikten sonra, cerrahi bir bisturi kullanılarak temiz bir kabine alınır. Cihazların çevresine dairesel bir kesik atılır.

Bıçağı, silikon gofretle temas edecek şekilde PDMS'ye yerleştirmek önemlidir, ancak gofrete çok fazla basınç uygulanmamalıdır; aksi takdirde master, cihazların etrafı boyunca tamamen kesilmiş bir daire şeklinde çatlayacaktır. Her bir üç inçlik silikon master'da dört adet cihaz bulunur. PDMS, master'dan dikkatlice kaldırılır.

Bu işlem, cerrahi bıçak önceki kesiğe yerleştirilirken nazikçe döndürülerek başlatılabilir. Kalıp üzerindeki PDMS cihazları gerçekten incedir. Sekiz milimetrelik bir doku biyopsi punch'ı kullanılarak cihaza yukarı bakan rezervuarlar açılır.

Zımba içinde kalan kalıntılar bir çubukla dışarı itilir. Ardından cihazlar dört parçaya bölünür ve cihazın bir Corning lam üzerine düzgünce yerleşmesi için fazla PDMS kısımları budanır. Kalan kalıntıları temizlemek için 24 mm x 40 mm boyutunda 1 numara cam lam ve azot gazı kullanılır.

İnatçı kalıntılar, 3M Scotch Brand 4 7 1 vinil bant kullanılarak da temizlenebilir. Temizlenen cihazlar artık plazma bağlanmasına hazırdır. Nöron cihazlarını lamlara kısa süreliğine bağlamak için bir herrick plazma temizleyici kullanılır.

Cihazlar ve lameller bir tepsiye yerleştirilir; ardından tepsi plazma temizleyiciye konur ve oda içerisindeki havayı tahliye etmek için bir vakum pompası kullanılır. PDMS cihazlarının ön yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirildiğinin belirtilmesi önemlidir. Yani, plazma gazına maruz kalmaları için tasarım yüzü yukarıya gelecek şekilde konumlandırılırlar.

Vakum basıncı 300 millitorr seviyesine ulaştıktan sonra, elektrik bobinine güç verilir ve yüksek ayara getirilir. Plazma oluşumuna yardımcı olmak amacıyla, hazneye az miktarda hava girmesini sağlamak için kapak hafifçe aralanır. Cihazlar ve örtü camı iki dakika boyunca plazma işlemine tabi tutulur.

Haznedeki mor renge dikkat edin. Bu gerçek plazmadır. Elektrik bobini; elektronlar, iyonlar ve nötr atomlar veya moleküllerden oluşan kısmi iyonize bir gaz olan plazmayı oluşturur.

Plazma, camın ve cihazın yüzeyinde, birlikte yerleştirildiklerinde kalıcı bir bağ oluşturacak reaktif türler meydana getirir. Plazma ayrıca yüzeyi hidrofilik hale getirerek sıvıların eklenmesini kolaylaştırır. Plazma temizleyici aynı zamanda cihazları sterilize eder.

İki dakikalık plazma işlemi sonrası, vakumdaki güç kapatılır ve hazneye hava verilir. Plazma ile işlem görmüş cam ve mikroakışkan cihaz yüzeyleri, steril bir kabin içerisinde birbirine temas edecek şekilde birleştirilir. Cihazlar daha sonra steril 60 milimetrelik petri kaplarına yerleştirilir.

Camın ve cihazın plazma ile işlem görmüş yüzeyleri sıkı ve geri dönüşümsüz bir bağ oluşturur. Plazma bağlama işleminden sonraki 10 dakika içinde, cihaz cama sabitlenir ve cihaza polyol lysine eklenir. 10 dakika sonra, cihazın hidrofilik özelliği azalacaktır.

PLL'nin cihaza girmesini zorlaştırır. PLL eklemesinden sonra cihazda hava kabarcığı olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Mevcut hava kabarcıklarını gidermenin kolay bir yolu, 100 microliters sıvı ile doldurulmuş bir P 200 pipet kullanmaktır.

Bu durumda, PLL ucunu doğrudan ana kanal açıklığına yerleştirin ve ardından P 200'e kuvvetle basın. Bu işlem birkaç kez tekrarlanması gerekebilir, ancak sonunda pipetten gelen kuvvet kabarcıkları dışarı atacaktır. PLL içeren cihazlar, 37 derece ve %5CO2 içeren standart bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübe edilir.

PLL ile 24 saatlik inkübasyonun ardından, cihazlar otoklavlanmış deiyonize su ile iki kez hızlıca durulanır. Bu işlem sırasında, ana kanallardaki sıvı asla tamamen uzaklaştırılmaz, yalnızca rezervuarlardaki sıvı uzaklaştırılır. Ana kanallardaki sıvının uzaklaştırılması hava kabarcıklarının oluşmasına neden olacaktır.

İki hızlı durulama işleminin ardından, cihazlar tekrar otoklavlanmış deiyonize su ile doldurulur ve minimum üç saat veya gece boyunca inkübatöre yerleştirilir. Ertesi gün, cihazlar su ile gece boyunca veya minimum üç saat inkübe edildikten sonra, tekrar biyogüvenlik kabinine alınır ve deiyonize su ile iki kez durulanır. Ardından, primer sıçan nöronlarının kültürü için gerekli takviyeleri, B 27 ve glutamatı içeren nöral bazal medya cihazlara eklenir.

Cihazlar daha sonra gelecekteki kullanımlar için tekrar inkübatöre yerleştirilir. Cihazlar artık nöron ekimi için hazırdır. Bu videoda, nöron cihazlarımızı üretmek için kullandığımız yumuşak litografi tekniğini göstermiş olduk.

Bu cihazlar, nöronların ve ilgilenilen diğer hücre tiplerinin kültürü için kullanılabilir. Bu cihazların temel avantajı, nöron hücre gövdelerinin cihazın bir tarafındaki kültürlenmesini, diğer taraftaki saf aksonal fraksiyondan ayırma ve bölmelere ayırma yeteneğidir. Bir sonraki videoda, E 18 fetal sıçan kortikal nöronlarını nasıl hazırladığımızı ve hücreleri cihaza nasıl yüklediğimizi göstereceğiz.

John Laboratuvarı'ndan paylaştıklarımız bunlardı. İzlediğiniz için teşekkürler.