Mikroakışkan Aygıt compartmentalization E18 Kortikal Rat Nöronlar hazırlanması

Merhaba, Dr. Newly John'un laboratuvarına hoş geldiniz. Önceki bir videoda, araştırmacının nöronların hücre gövdelerini saf bir aksonal fraksiyondan ayırmasına olanak tanıyan bir platform olan nöron cihazını nasıl ürettiğimizi göstermiştik. Cihazların yapımında, daha önce fotolitografi kullanılarak üretilen cihaz tasarımını içeren bir silikon gofret üzerine PDMS dökülmesi ve kürlenmesinden oluşan yumuşak litografi tekniği kullanılmaktadır.

Bu videoda, spro dolly E 18 kortikal sıçan nöronlarının hazırlanmasını ve nöronların nöron cihazına nasıl yükleneceğini göstereceğiz. Sizi Kiana Lee ile tanıştırmak istiyorum. Bugünki gösterimleri kendisi gerçekleştirecek.

İşleme başlamadan önce, gerekli tüm besiyerlerinin ve reaktiflerin su banyosunda 37 °C'ye ısıtılmış olması önemlidir. Burada neurobasal besiyeri, %0,25 tripsin ve %10 FBS içeren DMEM görebilirsiniz. Hücrelerin onarımı için laminer akışlı kabine yerleştirilecek her şeyin steril olduğundan ve %70 etanol ile silindiğinden emin olmak önemlidir.

Öncelikle, doku kültürü kabini %70 etanol ile silinir. Ardından, tüpleri tutmak için kullanılan plastik raflar etanol ile püskürtülür. Son olarak, tri-çizgileme işleminde kullanılan kauçuk top etanol ile temizlenir.

Kuruması için yeterli sürenin olduğundan emin olmak adına bu işlemin erken aşamada yapılması önemlidir. Ardından, gerekli reaktifler etanol ile silinir ve çeker ocağa taşınır. Daha önce diseksiyonu yapılmış bir beyni temsil eden, iki adet E 18 fetal sıçan korteks parçası; 1 ml buz gibi soğuk, kalsiyumsuz ve magnezyumsuz diseksiyon tamponu içeren 15 ml'lik bir tüpe yerleştirilir. Diseksiyon tamponundaki kortekse 1 ml 0,25% tripsin EDTA eklenerek nihai hacim 2 ml'ye ve nihai tripsin konsantrasyonu 0,125%'ye getirilir. Tripsin eklenmiş korteksi içeren 15 ml'lik tüp, fetal korteks 37 derecede tripsin ile inkübe edilirken sekiz dakika boyunca 37 derecelik su banyosuna yerleştirilir.

Üç adet pasta pipeti ateşle parlatılır. Cam pipetin ucu, alevin mavi kısmına yakın bir yerde alevle temas edecek şekilde yerleştirilir ve açıklık turuncuya dönene kadar yavaşça döndürülür. Turuncuya döndüğünde.

Cam pipeti, kapanmaması için sürekli döndürmek önemlidir. Cam pipetlerin açıklıklarının sırasıyla daha küçük olduğuna dikkat edin. Ayrıca, açıklıkları çok küçük yapmamanız gerektiğini belirtmek önemlidir; çünkü bu durum, korteksin trypsin ile 37 °C'de sekiz dakika inkübe edilmesinin ardından hücrelerin lizise uğramasına neden olabilir. Trypsin reaksiyonunu durdurmaya yardımcı olmak için kortekse %10 FBS içeren 10 mL DMEM eklenir.

Korteks ve %10 FBS'li DMEM içeren 15 ml tüp, 2.500 RPM'de iki dakika boyunca santrifüj edilir. Biyogüvenlik kabininde, korteksteki süpernatanı uzaklaştırmak için cam pipete bağlı vakum emişi kullanılır. Bu işlem sırasında peletin bozulmamasına veya yerinden oynamamasına dikkat edilir.

Korteks pelletine B 27 ve glutamat içeren 1 ml nöral bazal besiyeri eklenir ve pipetle nazikçe aşağı yukarı çekilerek karıştırılır. Pipetleme sırasında hava kabarcığı oluşmaması çok önemlidir, çünkü hava kabarcıkları oksidasyon yoluyla hücrelere zarar verebilir. Ardından, ucuna steril bir kauçuk pompa takılan ve en geniş açıklığa sahip olan, ateşle cilalanmış posterior pipet kullanılarak korteks yaklaşık beş kez aşağı yukarı çekilip bırakılarak tritürasyon yapılır.

Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilmelidir. Tamam. İşlem, her birinin açıklık boyutu daha küçük olan diğer iki cam pipetle devam ettirilmiştir. Daha önce belirtildiği gibi, üçlü çizgileme işlemi sırasında kabarcık oluşmadığından emin olmak önemlidir.

Ayrıca artık görünür herhangi bir parçanın kalmadığını fark etmelisiniz. Medyada korteksin herhangi bir parçasını görene kadar tritürasyona devam etmek önemlidir. İşlemden sonra hücreler tekrar 2, 500 RPM'de iki dakika boyunca santrifüj edilir.

Bu, iki korteks parçasından beklenmesi gereken peletin yaklaşık boyutudur. Santrifüjleme sonrası, süpernatant hücre peletinden bir kez daha uzaklaştırılır. Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra, kortekse B 27 ve glutamat içeren 1 ml nörobazal medya eklenir ve korteksin yeniden süspande edilmesi için kullanılır.

Hücre peleti, hava kabarcığı oluşumunu önlemek ve peletin eşit şekilde dağılıp parçalanmasını sağlamak için dikkatlice tekrar pipetlenir. Hücre süspansiyonuna bir ml daha nöro bazal besiyeri eklenerek son hacim iki ml'ye tamamlanır. Ardından, hücreleri saymak ve canlılığı değerlendirmek için yeniden süspanse edilen hücre çözeltisi, BD biosciences 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirilir.

Steril bir mikrosantrifüj tüpüne 60 µL taze nöral bazal besiyeri konur. Daha sonra 60 µL nöral bazal besiyerine 20 µL hücre eklenir ve son olarak, nöral bazal besiyerindeki hücrelere 20 µL tripan mavisi eklenir. Hücreler tripan mavisi ile boyandıktan sonra, tripan mavisi artık canlı olmayan hücreleri boyayacaktır.

Bir hemositometre üzerine 20 µL pipetleyip bunları mikroskop altında inceleriz. Canlı hücreler berrak ve şeffaf görünürken, membranları delinmiş hücreler tripan mavisi nedeniyle maviye boyanır. Tipik olarak, korteks başına yaklaşık 2,5 milyon hücre ve 8 milyon hücre elde ederiz.

Normalde, hücrelerin 2 mL nihai hacimde resüspande edildiği tek bir beyinden iki adet korteks parçası elde ederiz. Bu nedenle, hücrelerin nihai konsantrasyonu tipik olarak mL başına 2,5 milyon hücre ile 8 milyon hücre arasındadır. Normalde, cihaz başına yaklaşık 20 µL hücre yükleriz.

Bu, cihaz başına 50,000 hücre ile 160,000 hücre arasında bir hücre aralığı sağlar. Hücre yoğunlukları uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir. Ancak, primer nöronların çok düşük bir yoğunlukta ekilmesi tipik olarak hücre ölümüne yol açar. Nöral bazal medya içeren, önceden hazırlanmış cihazlar, steriliteyi korumak için biyogüvenlik kabinine getirilir.

Kuyucuklardaki fazla besiyeri bir vakum ünitesi ile uzaklaştırılır. Ancak, tüm besiyerinin uzaklaştırılmamasına dikkat edilmelidir. Ana kanalda bir miktar besiyeri kalmalı; sadece rezervuarlardaki besiyeri aspire edilmelidir.

Cihazın sol üst rezervuarına yalnızca 20 µL hücre uygulanır. Hücreler cihazın içine akar ve PLL ile işlem görmüş yüzeye tutunur. Burada hücrelerin ana kanal boyunca aşağı doğru aktığını görebilirsiniz ve bazılarının cam yüzeye tutunmaya başladığını fark edeceksiniz.

Yüklemeden sonra, hücreleri içeren cihazlar, hücrelerin tutunmasını sağlamak için yaklaşık 10 dakika boyunca tekrar bir inkübatöre yerleştirilir. İnkübatörde geçen 10 dakikanın ardından cihazlar yeniden biyogüvenlik kabinine getirilir, rezervuarlar besiyeri ile doldurulur ve ardından cihazlar tekrar inkübatöre yerleştirilir. İnkübatöre ve besiyerinin ihtiyaç duyduğu nem seviyesine bağlı olarak, cihazlardaki besiyerinin her iki veya üç günde bir değiştirilmesi gerekebileceği unutulmamalıdır.

Tüm rezervuarları doldurmadan önce, üst kuyucuklara taze besiyeri yerleştirmek ve bir miktar taze besiyerinin cihazdan geçerek ana kanallara akmasını sağlamak iyi bir uygulamadır. Nöronlar, burada canlı hücreleri boyayan hücre geçirgen bir boya olan kalsiyum am ile görselleştirilmiştir. Burada, hücre gövdelerini, aksonları ve dendritleri içeren cihazın so bölmesini veya hücre tarafını görebilirsiniz.

Cihaz üzerinde gezinirken, aksonların cihazın diğer tarafına, yani saf aksonal fraksiyon içeren akson tarafına ulaşmak için içinden büyüdükleri mikro kanalları görebilirsiniz. Gösterim amaçlı olarak, bu floresan işaretli hücreler aksonotomi prosedürünü örneklendirmek için kullanılacaktır.

Nöron cihazının özelliklerinden biri, araştırmacının cihazın saf aksonal fraksiyonundaki aksonları kesme işlemi olan aksonotomi yapmasına olanak tanımasıdır. Bu özellik, aksonal rejenerasyonun incelenmesi gibi araştırmaların yürütülmesini sağlar. Keano şimdi nöron cihazında aksonotomi işleminin nasıl gerçekleştirileceğini gösterecektir; aksonotomi, bir vakum yardımıyla gerçekleştirilir.

Steril bir cam pipet, kuyucuğun aksonal taraftaki alt açıklığına yerleştirilir ve besiyeri vakumla aspire edilir. Ana kanaldaki besiyeri de dahil olmak üzere, cihazın aksonal tarafındaki tüm besiyeri tamamen uzaklaştırılır. Besiyeri uzaklaştırıldıktan sonra işlemi tekrarlamak için, pipetin ucu ana kanalın açıklığına yerleştirilir ve pipet kuvvetle bastırılarak ana kanala 150 µL besiyeri verilmiş olur.

Ardından, ana kanalın açıklığına ve cihazın aksonal tarafındaki üst kuyucuğa vakum uygulanır. Ana kanal da dahil olmak üzere aksonal taraftaki tüm besiyeri ortamlari uzaklaştırmak için tekrar vakum kullanılır. Pipet ucu ana kanalın açıklığına yerleştirilip pipet kuvvetle bastırılarak ana kanala yeniden 150 µL besiyeri ortamı zorlanır.

Bu noktada, araştırmacı akson kesiminin verimliliğini kontrol etmek için cihazı bir mikroskop altında inceleyebilir. Aksonlar yeterince kesilmemişse, işlem gerektiği şekilde tekrar tekrarlanabilir. Bu videoda, E 18 fetal sıçan kortikal nöronlarının nasıl hazırlanacağını ve nöron cihazına nasıl yükleneceğini gösterdik.

Bu cihazların temel avantajı, nöron hücre gövdelerinin kültürlenmesini cihazın bir tarafında, saf aksonal fraksiyonu ise cihazın diğer tarafında olacak şekilde ayırma ve bölmelere ayırma yeteneğidir. Bu videoyu bilgilendirici ve faydalı bulduğunuzu umuyoruz. John Lab'den bizim için şimdilik bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler.