Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Aşağıdaki deneyin genel amacı, uzun menzilli ilişkili DNA partnerlerini keşfetmek ve tanımlamaktır. Bu işlem; fikse etme, hücre lizizi ve ardından ilk restriksiyon enzimi ile DNA sindirimi ve sonrasında iki ilişkili genden gelen segmentlerden oluşan kimerik bir DNA oluşturmak için ligasyon ile gerçekleştirilir. Daha sonra, amplifikasyonu kolaylaştırmak amacıyla ikinci restriksiyon sindiriminden sonra kimerik DNA'ya linkerlar eklenir; ilişkili DNA fragmanlarından yeterli miktarda elde etmek için linker ve yem DNA'ya özgü primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu yapılır. Amplifiye edilen DNA fragmanlarının sekans analizi temel alınarak, yem DNA ile uzun menzilli ilişkili DNA partnerlerini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin, kromozom onay yakalama veya 3C gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ACTSA'nın bilinmeyen uzun menzilli ilişkili DNA partnerlerini etkili bir şekilde tanımlamak için kullanılabilmesidir. Buna karşın 3C, yalnızca önceden şüphelenilen etkileşimlerin doğrulanması için geliştirilmiştir. Bu protokole başlamak için, insan hücrelerini 37 °C sıcaklıkta ve %5 karbondioksit sağlanan bir inkübatörde, %80 ila %90 konfluens seviyesine ulaşana kadar kültüre edin.

Bu gösterim için insan pro-Mlemiyel lösemi hücreleri kullanılmıştır. Hücreleri 50 mililitrelik bir NOC tüpüne aktararak toplayın ve 1200 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, besiyerini aspirasyon yoluyla uzaklaştırın.

Hücre peletlerini yeniden süspansiyona getirmek için beş mililitre kültür ortamı ekleyin. Hücreleri bir hemositometre ile saydıktan sonra, yaklaşık 1 × 10⁷ hücreyi %10 FBS içeren RPMI 1640 ortamı ile 40 mililitre hacme tamamlayın. Ardından, seyreltilmiş kromatini fikse etmek için 1,7 mililitre %37 formaldehit ekleyin.

Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyonun ardından, reaksiyonu 2,4 mililitre iki molar glisin ile durdurun. Ardından, numuneyi 1200 RPM'de ve dört derece celsius sıcaklıkta 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatan alındıktan sonra, peleti bir kez 40 mililitre buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve yıkanmış hücre peletini geri kazanmak için örneği santrifüjleyin; elde edilen peleti, yeni eklenmiş proteaz inhibitörleri ve 0,1 milimolar PMSF içeren 40 mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin ve örneği soğuk odada rotasyonla 90 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, örneği 2.500 RPM'de 15 dakika boyunca santrifüjleyip süpernatanı uzaklaştırın ve izole edilmiş çekirdekleri elde edin. Çekirdekleri 0,5 mililitre 1X NEB tampon üç içinde yeniden süspanse edin ve 15 mikrolitre %10 SDS ekleyin.

Numuneyi 37 °C'de bir saat boyunca çalkalayarak inkübe edin. Ardından, SDS'yi sekestre etmek için 45 µL %20 Triton X 100 ekleyin ve tekrar 37 °C'de bir saat boyunca çalkalayarak inkübe edin ve 1 × 10⁶'lık alikotlar alın. Restriksiyon enzimi sindirimi için 55 µL çekirdek çözeltisine yaklaşık 15 µg çekirdek kullanılır.

433 µL 1X NEB tampon çözelti 3 ve 12 µL BGL 2 ekleyin. Toplam sindirim reaksiyon hacmini 500 µL'ye tamamlayarak reaksiyonu 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, 95 µL %10 SDS ekleyerek restriksiyon enzimini inaktive edin ve enzimi 65 °C'de 20 dakika ısıtarak denatüre edin.

Bir su banyosunda, yedi mililitre 1x ligasyon tamponu ve 360 µL %20 Triton X 100 ekleyin. Örneği 37 °C'de bir saat inkübe edin. Sıcaklığı 16 °C'ye düşürün ve 400 unit/µL konsantrasyonda 50 µL ekleyin.

T dört DNA Ligaz ekleyin. Ligasyon reaksiyonunun dört saat boyunca 16 °C'de ve ardından 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilmesini sağlayın. Ligasyon tamamlandıktan sonra, 300 µg proteinaz K ekleyin ve gece boyunca 65 °C'de inkübe edin.

Ardından beş µg RNAA ekleyin ve 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. DNA'yı fenol kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve DNA'yı izopropanolde çöktürün; çöken DNA'yı 150 µL steril distile su içerisinde çözün. Kimera DNA'ya linker eklemek için, öncelikle iki µg saflaştırılmış DNA'yı beş ünite MspI ile 37 °C'de dört ila altı saat inkübe ederek DNA'yı sindirin; sindirim işleminin ardından, MspI'yi 65 °C'de 10 dakika boyunca inaktive edin.

Ardından, DNA'yı 5 mg/mL glikojenin 1 µL'si ile etanol içinde çöktürün. Elde edilen DNA peletini 50 µL steril distile su içerisinde çözün. Daha sonra, 50 µL MSP1 ile işlenmiş DNA'yı 2 µL 20 µM linker oligonükleotid L ve 1 µL 20 µM oligonükleotid S ile karıştırın; ardından 1 µL steril distile su ve 6 µL 10X T4 DNA Ligaz tamponu ekleyin.

Karışımın üzerini sıvı mum ile kapatın. Oligonükleotidleri 50 °C'de bir dakika boyunca denatüre edin ve dakikada 0,5 °C gradyanla 10 °C'ye kadar kademeli olarak soğumaya bırakın. Bir termal döngüleyici kullanarak, 400 units/µL konsantrasyonunda 1 µL T4 DNA ligaz ekleyin ve reaksiyonu 15 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, linker ligasyonu yapılmış DNA'yı bir kaya quick PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın ve 50 µL steril distile su içinde elüe edin. Uzun menzilli etkileşimler açısından incelenecek spesifik DNA bölgesi için bir primer seçin. Bu örnekte, primer veya yem olarak Abel kullanılacaktır.

Saflaştırılmış DNA'yı, bir mikrolitre saflaştırılmış DNA ile bir mikrolitre 20 mikromolar able bir spesifik primer (46 56) ve bir mikrolitre 20 mikromolar linker spesifik primeri (29 63) birleştirerek ilk tur PCR için hazırlayın. Ardından, yazılı protokole göre önceden 32 P-D-C-T-P ile karıştırılmış üç mikrolitre 3x ClinTech, DNA polimeraz 1 kokteyli ve ardından üç mikrolitre steril distile su ekleyin. PCR döngüsü tamamlandıktan sonra, yazılı protokolde açıklanan hot start PCR termal döngüsü kullanılarak PCR amplifikasyonunu gerçekleştirin.

Birinci tur PCR ürünlerini kaya hızlı PCR saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın. 30 µL steril distile su içinde elüye edin. İç içe geçmiş (nested) primerler kullanarak ikinci tur PCR'ı gerçekleştirmek için, 100 kat seyreltilmiş birinci PCR ürününden 1 µL kullanın; buna 1 µL 20 µM able one spesifik primeri (46 26) ve 1 µL 20 µM linker spesifik primeri (29 61) ekleyin.

Tekrar, üç mikrolitre 3x ClinTech, DNA polimeraz, tek kokteyl ve üç mikrolitre steril distile su ekleyin. PCR'ın ikinci turunu; 95 °C'de 20 saniye, 67 °C'de 40 saniye ve 72 °C'de bir dakika şeklinde 25 döngülük bir termal döngü programı kullanarak gerçekleştirin ve ardından 72 °C'de beş dakikalık bir uzatma aşaması uygulayın.

%5 üre sayfa jeli çalıştırarak PCR ürünlerini görselleştirin ve ardından pozlanmış ekranı bir fosfor imaj cihazında tarayın. Her bir PCR bandı, jel şeritlerinin 60 µL steril distile su içeren bir eppendorf tüpünde çözülmesi ve 95 °C'de beş dakika inkübe edilmesiyle jelden geri kazanılabilir. Çözünmüş jel ürünlerini 10.000 RPM'de 10 saniye boyunca kısa süreliğine santrifüjleyin.

Tüm numuneleri toplamak için. Prime repair ile PCR gerçekleştirmek amacıyla DNA kalıbı olarak kullanmak üzere bir mikrolitre alın. 29 61 46 26.

Yukarıda açıklanan koşullar kullanılarak, saflaştırma ve sekanslama analizinden sonra kromozomal konumu belirlemek için bir çevrimiçi araç kullanılabilir. Genom biyoinformatik sitesine girdiğinizde, yeni bir pencere açmak için blatt seçeneğine tıklayın ve DNA sekansını yapıştırın. DNA sekansı gönderildikten sonra, BLATT arama sonuçları görünecektir.

DNA dizisinin konumunu ortaya çıkarmak için %100 benzerliğe sahip vuruşa tıklayarak tarayıcıyı açın. Uzun menzilli DNA etkileşimlerini belirlemek için able one bölgesi yem olarak kullanıldı. İkinci tur PCR primer seti için iki BGL II bölgesi ve bir BAM HI bölgesi ACT analizi için seçildi; able M1'i amplifiye etmek için 46 26 29 61, able M2 için 46.30 29 61 ve able M3 için 46, 36 29 61 kullanıldı.

Tipik bir jel paterni, burada able M1, able M two ve able M three için gösterildiği gibi bir veya birkaç bandı ortaya çıkarır. Clone able M1'in DNA dizisi, bir A CT analizinden elde edilen her bir fragmanın iki birleşik DNA segmentinden oluştuğunu göstermek için sunulmuştur. Segmentlerden biri yem DNA bölgesinden türetilmişken, ikinci segment ilişkili partnerden gelmektedir.

Segmentler, birinci restriksiyon enzimi tanıma dizisi ile birbirine bağlanır. İkinci enzim tanıma dizisi, ilişkili partner dizisinin sonunda yer alacaktır. Klonlanabilir M1 fragmanı, kromozom 9 q 32.4'te bulunan ABLE 1 bölgesinden DNA içerir ve ilişkili partneri, proc 2 olarak tanımlanan kromozom 3 p 3'te yer alır.

Benzer şekilde, able M iki ilişkili partneri kromozom beş Q 21.1'e lokalize edilirken, clone able M üç, üç C analizlerinin aksine, ABLE bir lokusu yakınında bir intra kromozomal etkileşim olarak tanımlanmıştır. Bu videoda özetlenen metodoloji, en yaygın uzun menzilli etkileşimleri seçecektir. Bununla birlikte, PCR R döngü sayısı artırılarak, fare fibroblast hücrelerinde IGF iki H 19 lokusundaki imprinting ve kontrol bölgesi veya ICR'yi yem DNA olarak kullanarak, daha az yaygın olan ek etkileşimlerin belirlenmesi de mümkündür; A CT analizinde PCR'nin birinci ve ikinci turlarında farklı döngü programları uygulanmıştır.

A CT analizi, normal hücreler ile kanser hücreleri arasındaki nükleer mimari ve uzun menzilli etkileşimlerdeki farklılıkları belirlemek için de kullanılabilir. Normal kolon dokusu ve kolon kanseri dokusu homojenize edilmiş ve A CT analizi burada açıklanan prosedürler takip edilerek gerçekleştirilmiştir. Burada, IGF two H 19 lokusundaki ICR bölgesinin ve IGF two geni dpn'nin DNA yapısı gösterilmektedir.

A CT analizi için iki bölgede, ikinci tur PCR'da kullanılan işaretli primerler farklı renklerde oklar ve sayılarla belirtilmiştir. A CT analizinin jel paterni; 29 61 primerinin 41, 61, 41 63, 51 45 ve 51 51 primer çiftlerinden herhangi biriyle kullanıldığı PCR sonuçlarını temsil etmektedir. Sadece normal kolon dokusunda görülen özgün bantlar sarı oklarla, geliştirmesinin ardından sadece kolon kanseri dokusunda görülen bantlar ise kırmızı oklarla işaretlenmiştir.

Bu teknik, market biyolojisi alanındaki araştırmacıların nükleer mimariyi ve gen düzenlemesini üç boyutlu bir şekilde keşfetmelerinin yolunu açmaktadır.