Otomatik kullanarak Kromozomlar Yüksek throughput Fiziksel Haritalama

Bu prosedürün genel amacı, yüksek basınçlı kromozom preparasyonu, ardından otomatik floresan in situ hibridizasyon ve otomatik görüntüleme kullanarak DNA problarını sivrisinek politen kromozomlarına haritalamaktır. Bu işlem, öncelikle yüksek basınçlı bir yöntem kullanılarak politen kromozom yaymalarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, genomik DNA'nın bir Nick translasyon protokolü kullanılarak florokrom ile işaretlenmesi yoluyla floresan probların hazırlanmasıdır.

Üçüncü adım, otomatik lam boyama sistemleri kullanılarak floresan in situ hibridizasyon gerçekleştirilmesidir. Son adım ise, otomatik bir floresan görüntüleme sistemi kullanarak işaretlenmiş kromozomların taranması ve fotoğraflanmasıdır. Nihayetinde görüntüler, floresanla işaretlenmiş bir DNA probunun polikromozom üzerindeki lokalizasyonunu gösterebilir.

Bu tekniğin standart manuel in situ hibridizasyon protokolü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek verimli fiziksel haritalama protokolünün daha tutarlı sonuçlar üretmesi ve aktif çalışma süresini önemli ölçüde azaltmasıdır. Bu protokol, kan beslemesinden yaklaşık 25 saat sonra, ovaryumları Christopher'ın üçüncü evresindeyken toplamak amacıyla yarı yerçekimli ortamdaki dişilerin diseksiyonu ile başlar. Bu evrede, foliküller içindeki besleyici hücrelerin bulunduğu şeffaf alan yuvarlak bir şekle sahip olmalıdır; beş dişiden ovaryumlar toplanır ve taze hazırlanmış modifiye Carnoy solüsyonunun 500 µL'si içinde fikse edilir.

Ardından, oda sıcaklığında 24 saate kadar veya -20 °C'de daha uzun süre saklanabilirler. Sonrasında, over diseksiyon lamlarını hazırlamadan hemen önce, carnoise çözeltisi ve %50 propiyonik asit hazırlayın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, her bir over çiftini tozsuz bir lam üzerindeki taze carnoise çözeltisi damlasının içine yerleştirin.

Overleri diseksiyon iğnesi ile bölün. Tüm over parçalarını %50 propionik asit içeren altı temiz lam üzerine aktarın. Folikülleri diseksiyon iğneleri kullanarak birbirinden ayırın.

Ardından kalan dokuları kağıt havluyla silin. Bir damla daha %50 propionik asit ekleyin ve üç ila beş dakika bekleyin. Açıklama: Foliküllerin %50 propionik asit içinde üç ila beş dakika bekletilmesi, kromozom yayılımını önemli ölçüde iyileştirir.

Ardından, çekirdeklerin yayılması için bir lameli kapatıp bir dakika daha bekleyin. Lamı filtre kağıdı ve plastik ile sarın. Bir Dremel cihazını 3.000 ile 5.000 RPM arasına ayarlayın ve yaklaşık bir dakika boyunca, dönen Dremel ucunu lamelin üzerine hafifçe dairesel hareketlerle uygulayın.

Yayılma kalitesini faz kontrast mikroskobu ile doğrulayın ve kromozomları düzleştirmek için gerekirse dremel işlemini daha uzun süre uygulayın. Birinci lamın yanına ikinci bir lam yerleştirin, ardından lamları başka bir mikroskop ile sandviç şeklinde sıkıştırın. Ardından lamları plastik bir örtü ve filtre kağıdı ile sarın; sarılı lamları, 85 ile 120 inch pound arasında bir kuvvetle sıkıştırmak için bir mengeneye yerleştirin.

Altı lamın tamamında kromozomlar düzleştirildikten sonra, lamları sarılı oldukları malzemeden çıkarın ve kromozomları daha fazla düzleştirmek için fazla lamları ayırın. Lamları, bir lam denatürasyon hibridizasyon sisteminde 55 °C'de 10 ila 15 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, bir lamı en az 15 saniye veya kabarcık oluşumu durana kadar sıvı azotun içine daldırın.

Ardından lamelini bir jiletle hızlıca kaldırın ve lamı derhal beş dakika boyunca soğuk, %50 etanol içine yerleştirin. Bu işlemi her lam için sırayla tekrarlayın. Lamları sırasıyla %70, %90 ve %100 etanol banyolarındayehidre edin.

Bunları her bir banyoda beş dakika boyunca bekletin. Son olarak, lamlar havada kuruduktan sonra boyama işlemi için hazır hale gelirler. Prob işaretleme hariç, prosedürdeki adımların çoğu otomatik bir cihaz tarafından gerçekleştirilir.

Cihaza yüklemeden önce, ticari bir NIC translasyon protokolü kullanarak geri DNA'yı florokrom ile işaretleyip floresan probunu hazırlayın; prob hazırlandığında, lamları ve reaktifleri otomatik lam boyama sistemine yükleyin ve sistemi aşağıdaki adımları gerçekleştirecek şekilde programlayın. İlk olarak, 20 dakika boyunca 800 µL 1X PBS sağlayın.

İkinci olarak, lamları saç kurutma makinesi ile kurutun. Üçüncü olarak, lamları tek bir XPBS içinde %4 formalinin 450 microliters ile bir dakika boyunca sabitleyin. Ardından lamları %100 ethanol ile iki kez birer saniye ve ardından iki dakika boyunca yıkayın.

Etanol banyosundan sonra lamları tekrar hava ile kurutun. Kabarcık oluşumunu önlemek için lamları 45 °C'de iki dakika boyunca ısıtın. Ardından 20 µL DNA probu uygulayın, üzerine bir damla mineral yağı ve bir lamel ekleyin; ardından kromozomları 90 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.

Ardından slaytları 42 °C'de 14 saat boyunca hibritleşmeye bırakın. Hibritleşmenin ardından 42 °C'de iki dakika boyunca stringency yıkamaları yapın; bunu 2X SSC ile yapılan art arda dört adet bir saniyelik uygulama ve kurutma işlemi takip etmelidir. Sonra 42 °C'de iki kez 10 dakika boyunca 800 µL 0,4X SSC uygulayın ve ardından bir yıkama daha yaparak 25 °C'de 10 dakika boyunca 2X SSC uygulayın.

Şimdi 50 µL YO-YO-1 boyasını uygulayın, ardından mineral yağı ekleyip lamellerle kapatın. Lamları 25 °C'de 10 dakika inkübe edin. Daha sonra lamelleri kaldırın.

Slaytları iki XSSC içerisinde her yıkama için bir saniye boyunca dört kez yıkayın ve slaytları hava ile kurutun. Son olarak, her slayta 15 µL prolonged gold anti fade reaktifi uygulayın ve yeni lameller takın. Halojen ampul için Olympus U-R-F-L-T güç kaynağıyla başlayarak Accord plus otomatik tarama sistemine güç verin.

Ardından bilgisayarı ve son olarak kamera eklentili mikroskobu açın. Şimdi önce duet yazılım paketini açın, 10 x ön tarama ayarlarını yapın. Çevrimiçi butonuna tıklayın, yeni bir vaka ID'si girin ve bir lam ID'si atayın.

bf etiketli noktaya tıklayın. Bu, parlak alan (brightfield) seçeneğidir. Tarama seçeneği olarak 10 x ön taramayı seçin.

2.500 x daire, 10.000 x daire veya dikdörtgen seçeneğini seçin. Ayarla (set) ve çalıştır (run) düğmelerine tıklayın. Ardından, taramanın uygun şekilde ayarlanması için ekrandaki istemleri takip edin ve bitir (finish) düğmesine tıklayın.

Taramayı başlatmak için ana sekmeye basarak ana ekrana geri dönün. Şimdi çevrimdışı butonuna tıklayın, atanan vaka kimliğini ve lam kimliğini bulun. Ve çevrimdışı seçeneğine tıklayın.

Sol üst bölgedeki siyah kutuyu tarayın. Bir oka tıklayın ve 10 x ön taramayı seçin. İlgilenilen bir görüntü bulduktan sonra, taranan görüntüler arasında ilerlemek için okları kullanın.

Hedeflenen bölgenin ortasındaki ekrana çift tıklayın ve snap düğmesine basın. Bu işlem, tüm hedefler seçildikten sonra daha sonra yakalanmak üzere bir görüntüyü hedefler. Her görüntüye sağ tıklayın, classify seçeneğine tıklayın, 10 x pre-scan seçeneğini belirleyin ve polytan'ı seçin.

Ana menüye dönün ve 40 x ön taramayı ayarlayın. Tekrar çevrimiçi seçeneğini belirleyin ve bir lam seçin. BF'yi ffl olarak değiştirin ve görev adını revisit dash X 40 dash rg olarak değiştirin.

Son ayarın hemen altındaki bölümü "revisit dash all" olarak değiştirin. Ardından programı çalıştırın ve istemleri takip edin. Otomasyonu kurmak için, 10 x ve 40 x görüntülerini eşleştirmek üzere "start matching views" butonuna tıklayın.

Taramayı başlatmak için bitir'e tıklayın. İşlem tamamlandığında sınıflandır'a tıklayın ve görüntüleri inceleyin. Dişi anomali Gambiya'dan alınan over hemşire hücresi politan kromozom preparatları, yüksek basınç tekniği kullanılarak hazırlanmıştır.

Bu yöntem, kromozom yapısının çoğuna zarar vermez veya yapıyı değiştirmez. Bükülmüş kromozomları düzleştirir ve böylece standart preparatlarda görülmeyen gizli ince bantları ortaya çıkarır. Kromozom, S Gambia nd Tam back kütüphanesinden elde edilen back DNA klonları ile problanmıştır.

Kütüphane, anomaly S Gambia zararlı suşunun erkek ve dişi birinci evre yıldız larvalarından oluşturulmuştur. Bu prosedürü takiben, kromozom tabanlı genom montajlarının hızlı bir şekilde geliştirilmesini kolaylaştırmak amacıyla otomatik, yüksek verimli bir fiziksel haritalama gerçekleştirilebilir.