Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Bu protokol, yaygın olarak erişilebilen mikroskoplar ve açık kaynaklı yazılımlar kullanarak, Norky DIC optikleri veya floresan ile erken dönem C. elegans embriyolarındaki dinamik olayların nasıl görüntüleneceğini göstermektedir. Protokol, C. elegans embriyolarının nasıl diseke edileceğinin ve görüntüleme için nasıl monte edileceğinin açıklanmasıyla başlar. Ardından, en yüksek detayda optimal görüntüler elde etmek için DIC Nor masky optiklerinin uygun kurulumu gözden geçirilmektedir.

Açık kaynaklı yazılımlarla birlikte kaliteli floresan görüntü verileri toplamak için geniş alan epi-floresan ve aydınlatma kalibrasyonu da gözden geçirilmektedir. İyi bir mikroskopi, gelişmekte olan bir embriyodaki hücresel dinamikleri görselleştirebilir. Terminoloji kafa karıştırıcı olabildiği ve uygun tekniklerin yazılı olarak tarif edilmesi zor olduğu için, DIC Optik sisteminin doğru şekilde kurulması zordur; bu nedenle bu yöntemin görsel anlatımları kritik öneme sahiptir.

Ayrıca araştırmacılar, floresan görüntüleme yaparken ışığa maruziyeti minimize etmeye dikkat etmelidir. Fototoksisiteyi ve fotobeyazlamayı sınırlamak amacıyla, embriyoları görüntülemeye hazırlamak için öncelikle iki adet sabitleme çözeltisi hazırlayın. Bunlardan biri eritilmiş vazelin, diğeri ise tampon çözelti içinde %2 ila 3 oranında agarozdur.

Görüntülenecek yapılar çok hassas ise, kaynamasını önlemeye dikkat ederek daha yoğun aroslar hazırlanabilir. Her iki stok çözelti mikrodalga fırında eritilir ve ardından dörder veya beşer mililitrelik alikotlar halinde saklanır. Görüntüleme gününde, bir alikot Vazelin çözeltisini 65 ila 70 °C'lik bir ısıtıcı blokta eritin ve bir alikot aros çözeltisini mikrodalga fırında eritin.

Yine, kaynatmaktan kaçının. Ardından, bu çözeltilerin ergimiş halde kalması için onları bir ısıtma bloğunda saklayın. Sonrasında, iki lamın üst ve alt kısımlarını bir laboratuvar bandı şeridiyle kapatın ve temiz bir lamı, bantlanmış iki lamın arasına yerleştirin.

Şimdi, erimiş aros'tan birkaç damlayı temiz lam üzerine damlatın ve üzerini başka bir temiz lamla kapatın. Aros, solucan pedi hazırlanmış şekilde ince kare bir ped haline gelecek şekilde yayılır. Bir diseksiyon mikroskobu ve platin tel pens kullanarak, iki adet yetişkin solucanı 18 by 18 milimetrelik bir lamel üzerindeki 9 ila 12 µL'lik bir tampon damlasına aktarın.

Ardından kesin. Embriyoların salınması için solucanları, agar tarafı aşağı gelecek şekilde bir iğne veya bistüri ile açın. Solucan pedini 18 by 18 milimetrelik lamelle yerleştirin ve taşan agar kısımlarını jiletle temizleyin.

Son olarak, lameli mühürlemek için eritilmiş vazelin çözeltisini bir boya fırçası veya kürdan yardımıyla çevresine uygulayın. Hücreler artık görüntüleme için hazırdır. Lamı mikroskoba yerleştirirken, iki polarizörün birbirine dik olarak hizalandığından emin olun.

Hem waller'ların hem de prizmaların ışık yolunun dışında olduğundan emin olun. Alan karanlık değilse, karanlık olana kadar kondansatörün altındaki polarizatörü döndürün. 10x objektif kullanarak embriyoları bulun.

Görüntüleme alanında birden fazla embriyo elde etmek için solucan gövdelerinin yakınındaki genç embriyo gruplarına bakın. En iyi görüntüler için solucanın içindeki embriyolardan kaçının. En uygun embriyolar belirlendikten sonra, daha yüksek büyütmeli bir objektife geçiş yapın.

Şimdi filtre küpünü DIC konumuna getirin. Ardından, üst objektif Wollaston prizmasını ışık yoluna yerleştirin ve objektifle eşleşen alt Wollaston prizmasını seçmek için kondansatör üzerindeki taretle döndürme işlemini yapın. Prizmalar yerleştirildikten sonra, lensin sayısal açıklığına uygun şekilde bu taretin altındaki sürgüyü ayarlayın.

Optimal Kohler aydınlatması elde etmek için, kondansatör diyaframının kenarı en net hale gelene kadar kondansatörü odaklayın. En net durum, ışık ile siyah arasındaki sınırın en belirgin veya odakta olduğu andır. Optimal kontrastı sağlamak için, sürgü üzerindeki düğmeyi çevirerek diyafram duvarını ve prizmayı ayarlayın.

Artık mikroskop neredeyse kullanıma hazır. Şimdi, micromanager ve açık kaynaklı yazılım ile bilgisayar üzerinden ek görüntüleme parametrelerini kontrol etme zamanı. Kamera kazancını (gain) sıfıra ayarlayarak başlayın.

Ardından, dosyaları 16 bit değil, sekiz bit TIFF olarak kaydedecek şekilde ayarı değiştirin. TIFF dosyaları daha sonra Image J gibi açık kaynaklı yazılımlarla analiz edilebilir. Sonrasında, ışık seviyesini en parlak piksellerin doygunluk seviyelerinin hemen altında kalacağı şekilde ayarlayın. Her şey doğru yapılmışsa, ışık belirli bir açıyla geliyormuş gibi görünerek görüntü 3D bir görünüm kazanacaktır.

Görüntü netleştiğinde, görüntülemek istediğiniz embriyoları seçin ve bir ilgi alanı (ROI) çizin. Mikroskobun bir odak motoru varsa, her zaman diliminde birden fazla odak düzlemi toplamak için bunu kullanın. Çok boyutlu veri toplama penceresini açın ve odak düğmesini ayarlayarak, bazı sarı granüllerin odakta olduğu ilk ve son odak düzlemini bularak Z yığını üst ve alt düzlemini belirleyin.

Adım boyutunu ayarlayın. Bu, toplanacak odak düzlemlerinin sayısını belirleyecektir. Şimdi, tüm odak düzlemlerini elde etmek için yeterince uzun bir zaman aralığı belirleyin.

Yazılım manuel olarak durdurulana kadar görüntü almaya devam etmesi için maksimum zaman noktaları çok yüksek olarak ayarlanabilir. Sürecin izlenebilmesi için yazılımı sadece alınan son görüntüyü gösterecek şekilde ayarlayın. Şimdi görüntülere bir dosya adı verin ve görüntüleri almaya başlayın.

Görüntü analizi, bir sonraki bölümün sonunda kısaca gözden geçirilecektir. Bir GFP filmi oluşturmak, dört D veya Musky DIC yapmaya çok benzer, ancak floresan kapatıcının yazılım kontrolünü içeren bir yapılandırma dosyası kullanılır. Embriyolar konumlandırıldıktan sonra, üstten aydınlatma prizmasının ışık yolunda olmadığından emin olun ve filtre kübünü F-I-T-C-G-F-P olarak değiştirin.

Yazılım tarafından başlangıçta otomatik olarak ayarlanmadıysa, kamera kazancının (gain) 255 olarak ayarlandığından emin olun. Görüntü dosyası 16 bit tiff formatına ayarlanır. Şimdi iletim ışık kaynağını kapatın ve canlı görüntüleme (live imaging) seçeneğine tıklayın.

Floresans sinyali için iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek amacıyla UV ışık kaynağının yoğunluğunu ve pozlama süresini ayarlayın, ancak hücreleri korumak için ışık maruziyetini minimumda tutun. Ardından, zaman aralığını belirleyin. Zaman noktası sayısını ve odak düzlemi sayısını ayarladıktan sonra, daha önce açıklandığı şekilde görüntüleme işlemine geçin.

Filmleri analiz etmek için açık kaynaklı yazılımlar kullanın. Micromanager eklentisi yüklü Image J'den yararlanın. Çok büyük boyutlu filmler, loci eklentisi kullanılarak da Image J'ye aktarılabilir. Bu, nor masky ile DIC optikleri kullanılarak görüntülenmiş bir yaban tipi embriyodur.

Posterior alt sağa, ventral ise alt sola doğrudur. Video, her 15 saniyede bir toplanan tek odak düzlemi görüntülerinden oluşan bir diziyi göstermektedir. Oynatma hızı saniyede 14 kare olarak ayarlanmıştır.

Bu embriyo, ilk embriyonik bölünme sırasında floresans göstermektedir; burada posterior bölge sağ üst taraftadır. Bu video, her 10 saniyede bir tek bir odak düzlemindeki değişimleri göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik olayları incelemek için hem DIC Naski optikleri hem de epi-floresans kullanarak canlı embriyoların nasıl görüntüleneceğine dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

DIC Nomar optiklerinin optimum görüntüler elde etmek için nasıl kurulacağına dair daha iyi bir anlayış kazandığınızı ve her zaman daha gelişmiş mikroskoplara bağımlı kalmadan, epi floresans aydınlatması kullanarak yüksek kaliteli floresan verileri elde edebileceğinizi fark ettiğinizi umuyoruz. Ayrıca, hücre bölünmesi veya gelişimi sırasındaki favori olaylarınız için genetik gereklilikleri daha ayrıntılı incelemek amacıyla, bu görüntüleme tekniklerini belirli gen fonksiyonlarından yoksun embriyoları incelemek için de uygulayabilirsiniz.