Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme C. elegans Embriyo

Aşağıdaki deneyin genel amacı, C zarafet embriyogenezi sırasında gelişmekte olan bir doku içindeki hücrelerin bölünmesini gözlemlemektir. Hücre bölünmesini kontrol eden genleri incelemek için, bu, ilgilenilen hücreleri etiketleyen transgenik belirteçleri kararlı bir şekilde ifade eden bir C elgan suşu oluşturarak veya elde ederek elde edilir. İkinci adım olarak, D-S-R-N-A'yı 24 ila 48 saat boyunca dört larva ile besleyerek ilgilenilen bir geni seçici olarak yıkın.

RNAI embriyoları, grafik hermafroditlerden toplanır ve canlı görüntüleme için bir aros pedine aktarılır. Daha sonra, hücre bölünmesi fenotiplerini görselleştirmek için geniş alan veya konfokal mikroskopi kullanılarak embriyolar görüntülenir. Sonuçlar, deniz elgininin embriyogenezi sırasında nöroblastın nasıl bölündüğünü ve bölünmeleri için gerekli genlerin rolünü gösterecektir.

Bu yöntem, gelişim ve hücre biyolojisi alanındaki temel soruların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir. Örneğin, bu yöntem, doku gelişimi, hücre hücresi iletişimi, hücre göçü veya hücre polaritesi sırasında mitozun düzenlenmesinde rol oynayan genleri ve mekanizmaları ortaya çıkarabilir. 24 ila 48 saat boyunca kontrol veya RNAI plakalarında tutulan uygun belirteçleri ifade eden transgenik solucanlar kullanın.

Dört ila altı mezar yetişkini seçin ve bunları bir depresyon slaytında 20 ila 30 mikrolitre M dokuz tamponuna aktarın Embriyoları serbest bırakmak için steril bir neşter kullanın, spermatheca veya vulvanın her iki tarafındaki solucanları kesin. Daha sonra, bir pipet ampulüne bağlı ve embriyoları geçecek kadar geniş olan çekilmiş bir kılcal damar kullanarak embriyoları toplayın. Embriyoları bir kürdan üzerine yapıştırılmış bir kirpik kullanarak taze hazırlanmış bir aros pedine aktarın.

Embriyoları yan yana iterek beş ila 10 embriyodan oluşan gruplar oluşturun. Sürgüyü bir kapak fişi ile kapatın ve gerekirse daha fazla M dokuz tampon ekleyin, ardından kapak fişini önceden ısıtılmış sıvı valla ile kapatın. Otomatik filtreler içeren bir epi floresan geniş alan mikroskobu kullanın.

Objektifler, yüksek çözünürlüklü bir CCD kamera ve son derece motorlu bir sahne. Hepsi yazılımla kontrol edilir. Bu sistem onlara sahip olmasa da, LED'ler ve bir E-M-C-C-D kullanarak, düşük büyütme ile embriyoya fototoksisiteyi sınırlayacaktır.

Nöroblastı görüntülemek için embriyolara manuel olarak odaklanın. Büyütmeyi artırın ve geniş alan mikroskobunda dorsal inter harmanlama veya erken ventral kapanma geçiren embriyoları seçin. GFP ve Texas kırmızı filtrelerini seçin ve geniş alan sisteminde en uygun Z düzlemlerini belirleyin.

Daha az Zack ve daha az zaman noktası kullanmak fototoksisiteyi azaltacak, ayrıca diyaframı %30'a kadar kapatacak ve mümkünse ışık yoğunluğunu azaltmak fototoksisiteyi daha da azaltacaktır. Alternatif olarak, tarama lazerlerinin hedeflerini kontrol eden yazılım, EMCD kamera ve yüksek motorlu bir sahne ile canlı taramalı bir süpürme alanı veya eğirme diskli konfokal mikroskop kullanın. Artık alım ayarları optimize edildiğine göre, embriyoları geniş alan mikroskobunda görüntüleyin.

RNAI Embriyolarından önce kontrol embriyolarının filme alınması önerilir. Süpürülmüş alan sistemi ile. 4 88 ve 5 61 100 miliwatt lazerleri 50 miliwatt'lık bir yarık ve 300 milisaniyelik bir pozlama süresi ile %40 güce ayarlayın.

Bu ayarların diğer mikroskoplar için farklı olacağına dikkat etmek önemlidir. Slaytı mikroskop tablasına yerleştirin, ardından embriyoları bulmak için düşük büyütme objektifi kullanın. Ardından 60 veya 100 x yağa daldırma hedefine geçin.

Odaklandıktan sonra, toplam 20 dakika boyunca her iki dakikada bir 0.2 mikronda 10 Z yığını toplayın. Maruz kalma süresi muhtemelen ince ayar gerektirecektir. Floresan mikroskobu ile embriyoları canlı görüntülerken, diyaframı kapatırken, daha az Zack veya zaman noktası seçerken fototoksisite dikkate alınmalıdır.

Maruz kalma süresinin azaltılması, mümkünse fototoksisiteyi sınırlayabilir. Bir SW alanı veya dönen diskli bir konfokal mikroskop kullanmak bu sorunu iyileştirmeye yardımcı olabilir. Satın alma yazılımını kullanarak zamanınızı, puanlarınızı ve ilgilendiğiniz Z düzlemlerini belirleyin.

İstenen görüntüleri birden çok tiff olarak dışa aktarın. Image J gibi işleme yazılımlarında ilgilenilen her zaman noktası ve kanal için istenen Z düzlemlerini açın ve genellikle yalnızca birkaç düzlemi kapsayan bir yığın nöroblast oluşturun. Her zaman noktası için Z düzlemlerini istifleyin ve Z yığını projeksiyonları oluşturun.

Ek kanallar için bunu tekrarlayın. İstenen zaman noktaları için tüm Zack projeksiyonları tamamlandığında, bir zaman dizisi oluşturmak için projeksiyonları açın. Bunu her kanal için ayrı ayrı yapın.

Her kanal için parlaklık ve kontrastta gerektiği gibi ayarlamalar yapın. Gerekirse görüntüleri döndürün. Ardından bir ilgi alanı seçin ve görüntüleri kırpın.

Şimdi birleştirilmiş kanallar işlevini kullanarak birleştirilmiş bir görüntü oluşturun. Her kanal için farklı bir renk seçme. Görüntüleri daha net görselleştirmek için birleştirilmiş görüntüyü bir RGB dosyası olarak kaydedin.

16 bit TIFF görüntülerini kullanın ve her kanal için gri tonlamalı görüntüler oluşturmak için düzenle altında ters çevir işlevini seçin. Mikronlarla ilgilenilen bir nesnenin boyutunu belirlemek için, bir çizgi çizin ve uzunluğunu, görüntüleme parametreleri tarafından belirlenen piksellerin boyutuyla çarpın. Şimdi, hesaplanan uzunluğun mikron cinsinden bir oranını temsil eden bir ölçek çubuğu yapın.

Son olarak, son görüntüleri sekiz bitlik tiff olarak kaydedin. İstenirse, görüntü J epidermal kullanarak tiff'leri filmlere dönüştürün. C zarafetinin morfogenezi epidermal hücre şekil değişiklikleri, migrasyon ve adezyonun bir kombinasyonu ile altta yatan proliferatif nöroblastın yardımıyla ortaya çıkar.

Epidermal hücreler ventral orta hatta göç eder ve nöroblast bölünmesini incelemek için tek bir hücre tabakası oluşturur embriyolar, stabil bir şekilde koeksprese eden ve GFP ile etiketlenmiş nöroblast spesifik belirteç ve m kiraz ile etiketlenmiş maternal tahrikli bir membran markörü, artan büyütmede ventral muhafaza sırasında görüntülendi. Nöroblast bölünme geçiriyor olarak görselleştirildi, nöroblast çekirdekleri yeşil renkle gösterildi ve çevreleyen zarlar kırmızı renkle gösterildi, bir kontrol embriyosunda mCherry zar probu ile özetlenen bölünen nöroblastın hızlandırılmış görüntüleri, kontrol embriyolarında bölünen nöroblastı daha iyi görselleştirmek için geniş alan mikroskobu kullanılarak yakalandı. Her kanal gri ölçekte tutuldu ve görüntüler süpürülmüş alan konfokal mikroskopi kontrol embriyoları kullanılarak ters çevrildi.

Jambon bir GFP ve M kiraz pH'sını eksprese eden Coex, bölücü nöroblast olan bir bölgede görüntülendi. Kötü bir ifadeyi yıkmak için RNAI ile tedavi edilen aynı embriyolar, geniş alan mikroskobu kullanılarak görselleştirildi. Kontrol embriyolarının aksine, birçok nöroblast bölünme sırasında durdu veya geriledi ve süpürülmüş alan mikroskobu kullanılarak çok çekirdekli hale geldi.

Ayrıca birçok nöroblastın bölünme sırasında durduğu veya gerilediği ve çok çekirdekli hale geldiği açıktı. Bu teknik, doku oluşumu sırasında göç eden hücreleri görüntülemek için de kullanılabilir. Ayrıca, Zacks'iniz daha hızlı görüntülemeye izin vermek için kullanılıyorsa, hücre altı dinamikleri hakkında daha fazla bilgi elde edilebilir.

Ayrıca, uygun ekipmanla, bu teknik, optogenetik gerçekleştirmek için foto ayarlanabilir probların aktivasyonu için kullanılabilir. Ayrıca, protein, protein etkileşimleri veya protein dinamiklerini incelemek için fret veya fret gibi mikroskopi teknikleri uygulanabilir.