iCLIP - Bireysel Nükleotid Çözünürlük protein-RNA Etkileşimleri Transcriptome geniş Haritalama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir RNA bağlayıcı proteinin bağlanma bölgelerinin tek nükleotid çözünürlüğünde transkriptom çapında bir haritasını çıkarmaktır. Bu, ikinci bir adım olarak, proteinlerin ve RNA'nın in vivo olarak kovalent şekilde çapraz bağlanması için canlı hücrelerin UV ışınlamasına tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Çapraz bağlanmış RNA fragmanlarını geri kazanmak için RNA bağlayıcı protein, katı koşullar altında immünopurifiye edilir.

Ardışık ters transkripsiyon, genellikle ekli peptit noktasında kesilen ve böylece RNA içindeki çapraz bağ konumuna dair bilgiyi koruyan cDNA'lar üretir. cDNA kütüphanesinin yüksek verimli sekanslaması sonucunda, transkriptom içindeki tüm bağlanma bölgelerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, farklı RNA bağlayıcı proteinlerin etkileşiminin RNA işlemeyi nasıl düzenlediği gibi RNA biyolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, protein-RNA etkileşimlerinin transkriptom genelindeki haritalarının hem performansını hem de çözünürlüğünü artırmamızdır. Doku kültürü hücrelerinin UV çapraz bağlama prosedürüne başlamak için.

10 santimetrelik bir healer hücresi plağından besiyerini uzaklaştırın. Altı mililitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve plakaları buz üzerine yerleştirin. Bir plak üç deney için yeterlidir.

Kapağı çıkarın ve hücreleri ışınlayın. 254 nanometrede, santimetrekare başına 150 milijoule ile işlem tamamlandığında, hücreleri bir hücre kaldırıcı yardımıyla plakalardan sıyırarak toplayın; hücreleri çöktürmek için her bir mikro tüpe iki mililitre hücre süspansiyonu aktarın. Hücreleri 4 °C'de, maksimum hızda 10 saniye boyunca santrifüjleyin.

Ardından süpernatan şapı kaldırın, hücre peletlerini kuru buz üzerinde dondurun ve kullanıma kadar -80 °C'de saklayın. Her deney için yeni bir mikrotüpe 100 µL protein dyna beads ekleyin. Fare veya keçi antikorları ile çalışılıyorsa, protein G dyna beads kullanın.

Boncukları, beraberindeki yazılı protokolde belirtilen lizis tamponu ile iki kez yıkayın. Boncukları, 2 ila 10 µg antikor içeren 100 µL lizis tamponu içinde yeniden süspande edin. Tüpü oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca döndürün.

Ardından boncukları üç kez 900 µL lizis tamponu ile yıkayın ve işleme devam etmeye hazır olana kadar son yıkama çözeltisinde bekletin. İmmünopresipitasyon için buz üzerinde Thor hücre pelletini yeniden süspande edin; bir mL lizis tamponu içinde süspande ederek 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.

RNA'lardan birini 1/500 oranında seyreltin. Ardından, hücre lizatına 10 µL seyreltilmiş RNA ile birlikte 2 µL turbo DNA ekleyin. Örnekleri 37 °C'de, dakikada 1.100 devirle çalkalayarak tam olarak üç dakika boyunca inkübe edin ve hemen buza aktarın.

Ardından, lizatı berraklaştırmak için örnekleri 4 °C'de ve 22,000 ×g'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin; boncukları immünopresipite etmek için pelet ile birlikte yaklaşık 50 µL lizat bırakarak süpernatanı dikkatlice toplayın. Yıkama tamponunu uzaklaştırın, ardından hazırlanan hücre lizatlarını ekleyin. Örnekleri 4 °C'de iki saat boyunca rotasyona bırakın.

SUP ajanını atın ve boncukları, ekteki yazılı protokolde bulunan 900 mikrolitre yüksek tuz tamponu ile iki kez yıkayın. Son olarak, boncukları 900 mikrolitre yıkama tamponu ile iki kez yıkayın. Ardından, RNA'nın üç prime uçlarını defosforile etme ve bir bağlayıcı ekleme işlemine geçin.

RNA beş prime uçlarını etiketlemek için işlemi bir pleksiglas kalkan arkasında gerçekleştirin. Linker ligasyon reaksiyonunun son yıkamasındaki süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları sekiz µL sıcak PNK karışımı içinde yeniden süspanse edin. 37 °C'de beş dakika inkübe edin.

Sıcak PNK karışımını uzaklaştırın ve yeniden kullanın. Boncukları 20 µL bir kat yeni sayfa yükleme tamponu içerisinde süspande edin. Ardından örneği bir termo mikserde 70 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

Boş boncukları çöktürmek için örneği hemen bir mıknatıs üzerine yerleştirin. Üretici talimatlarına göre, örnekleri %4 ila %12'lik yeni bir SDS-PAGE jeline yükleyin.

Ayrıca, beş µL ön boyamalı protein boyut belirteci yükleyin. Jeli 180 voltajda 50 dakika boyunca çalıştırın. Protein RNA komplekslerini, üretici talimatlarına uygun olarak NOVA ıslak transfer cihazını kullanarak jelden nitroselüloz membrana aktarın.

Transfer işleminden sonra, membranı PBS tamponu ile durulayın. Ardından Saran wrap ile sarın ve eksi 80 °C'de filme pozlayın. Pozlama işlemlerini 30 dakika, bir saat ve gece boyunca gerçekleştirin.

Ardından, düşük RNA miktarlarına göre protein RNA komplekslerinden membran bölgesini izole edin. Maske olarak autoradyogramı kullanarak deney yapın. Proteinaz K sindirimi ve fenol kloroform ekstraksiyonu ile RNA'yı membrandan geri kazanın.

cDNA'yı jel ile saflaştırmak için AYP primerlerinden birini kullanarak RNA'yı ters transkribe edin. Altı mikrolitre cDNA örneğini altı mikrolitre 2x TBE üre yükleme tamponu ile karıştırın. Örnekleri jele yüklemeden hemen önce.

Numuneleri üç dakika boyunca 80 °C'ye ısıtın. Ardından, numuneleri düşük moleküler ağırlıklı bir marker ile birlikte önceden hazırlanmış %6 TBE üre jeline yükleyin. Üst boyayı ve plastik jel desteği üzerindeki işaretleri kesim işlemi için kılavuz olarak kullanarak, jelin üretici tarafından belirtildiği şekilde 180 volt değerinde 40 dakika boyunca çalışmasına izin verin.

120 ila 200 nükleotid, 85 ila 120 nükleotid ve 70 ila 85 nükleotid boyutunda üç bant kesin. Arc lip primer'ının ve L üç dizisinin birlikte klip dizisinin 52 nükleotidini oluşturduğunu unutmayın. 400 µL TE ekleyin ve jel dilimini küçük parçalara ayırın.

Bir mililitrelik şırınga pistonu kullanarak gel parçalarını 37 °C'de, dakikada 1.100 devirle çalkalayarak iki saat boyunca inkübe edin. Bir CoStar spinx kolonuna iki adet bir santimetrelik cam ön filtre yerleştirin. Numunenin sıvı kısmını kolona aktarın ve dakikada 13.000 devirle bir dakika boyunca 1,5 mililitrelik bir tüpe santrifüjleyin.

0.5 µL glyco blue ve pH 5.5 sodyum asetatın 40 µL'sini ekleyin. Ardından numuneyi karıştırın. 1 mL %100 etanol ekleyin.

Tekrar karıştırın ve örneği -20 °C'de gece boyunca çöktürün. Son olarak, adaptör bölgesini 5' ucuna eklemek için CD NA moleküllerini daireselleştirin. Ardından, eye clip kütüphanesinin dizilenmesinden önce beraberindeki yazılı protokole uygun olarak yeniden lineerize edin ve PCR ile amplifiye edin; deneyin başarısı iki aşamada izlenebilir.

Membran transferi sonrası protein RNA kompleksinin autoradyografında ve düşük RNA örneklerinin autoradyografındaki PCR ürünlerinin jel görüntüsünde, yüksek RNA örnekleri için proteinin moleküler ağırlığının üzerinde yaygın radyoaktivite görülmelidir. Bu radyoaktivite, proteinin moleküler ağırlığına daha yakın bir noktada yoğunlaşmıştır. İmmünopresipitasyonda antikor kullanılmadığında ise herhangi bir sinyal tespit edilmemelidir.

İmmünopresipitasyonun özgünlüğü için gereken diğer önemli kontroller, ya UV ışınlaması yapmayı ya da ilgilenilen proteini eksprese etmeyen hücrelerin kullanılmasını içerir. PCR ürünlerinin jel görüntüsü, cDNA fraksiyonuna karşılık gelen bir boyut aralığı göstermelidir. PCR primerleri P3 Celexa ve P5 Celexa'nın, cDNA boyutuna ek olarak 76 nükleotid eklediğine dikkat edin. İmmünopresipitasyon sırasında herhangi bir antikor kullanılmazsa, buna karşılık gelen herhangi bir PCR ürünü tespit edilmemelidir.

Bu prosedür uygulanırken, 64 adımın her birinin kritik olduğu ve yüzde yüz doğrulukla gerçekleştirilmesi gerektiği unutulmamalıdır. ICL verileri, transkriptom çapındaki fonksiyonel analizlerle hesaplamalı olarak entegre edilebilir. Bu durum, örneğin RNA işlemenin konuma bağlı düzenlenmesi hakkında içgörüler sağlayabilir.

Hesaplamalı veri analizi için, Nicholas KA European Bioinformatics Institute ve Liana Üniversitesi'nden bla zupan ile gerçekleştirdiğimiz güncel yayınlarımıza başvurmanızı öneririz. Artık kendi deneylerinize başlama zamanı. İyi çalışmalar.