Polarize Epitel Hücreleri içine Plazmidler, Mikroenjeksiyon Küçük GTPases Fonksiyon Analizi

Bu prosedür, küçük GTP ACE'lerin polarize membran trafiği üzerindeki etkilerini analiz eder. İlk olarak, küçük GTP ACE ve raporlayıcı proteinleri kodlayan DNA plazmitlerini polarize hücrelerin çekirdeklerine birlikte enjekte edin. Ardından, küçük GTPAle sitozolde birikirken, raporlayıcı proteinleri endoplazmik retikulumda veya TGN'de tutacak sıcaklıklarda DNA'yı eksprese edin; daha fazla protein sentezini önlemek için sikloheksimid varlığında raporlayıcı proteinin hücre yüzeyine taşınmasını sağlayın.

Son olarak, immünofloresan analizi için hücre yüzeyindeki raporlayıcı proteini işaretleyin. Bu analizden elde edilen sonuçlar, konfokal mikroskopi aracılığıyla yüzey lokalizasyonundaki değişimin görselleştirilmesine olanak tanır. Bu tekniğin transfeksiyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mikroenjeksiyon ile elde edilen kısa süreli aşırı ekspresyon sırasında sekonder etkilerin minimum düzeyde kalması ve böylece ilgilenilen proteinlerin primer etkilerini incelememize imkan tanımasıdır.

Bu yöntem, küçük GTPazların polarize membran trafiğini nasıl düzenlediği gibi hücre polaritesi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Başarılı bir mikroenjeksiyon için gerekli olan münferit adımların görsel yardım olmadan açıklanması zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır. Sigma Aldrich endotoksin içermeyen maxi prep kiti ile üretici protokolüne uygun olarak endotoksin içermeyen plazmit DNA izole edin. Bu deneyde, kültürleme için 0,4 µm gözenek boyutuna sahip üç adet şeffaf 12 mm transwell filtre kullanın.

Her filtreye beşinci pasaj MDCK hücrelerinden 4 × 10⁴ adet ekilir. İki gün sonra, hücrelerin kapalı bir monokatman halinde büyüdüğünü doğrulamak için kültür mikroskop altında incelenir. Mikroenjeksiyon için.

Mikroenjeksiyon gününde, beş litre MM büyüme besiyeri artı 15 milimolar heis içeren 360 x 15 milimetrelik plakalar hazırlayın ve bunları 39 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Ayrıca, bir mililitre MEM büyüme besiyeri artı 50 milimolar heis ve 0,1 mg/mL sikloheksimid içeren üç adet 12 kuyucuklu plaka hazırlayın ve bunları 31 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Mikroenjeksiyon mikroskobunu açın; ısıtmalı tabla, 10x ve 32x objektifler ile bir einor femto jet içeren bu ters mikroskobu kurun.

Isıtmalı tabla 39 °C'ye ayarlayın. Ayrıca hava tablosuna giden nitrojen gazı tankı beslemesini açın. Şimdi DNA'yı, son konsantrasyonu 0.2 mg/mL olacak şekilde filtreli su ile seyreltin.

Ardından, DNA'yı bir mikro santrifüjde 13,000 RPM hızında 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst kısmı alarak yeni bir tüpe aktarın. Daha sonra, MDCK hücrelerini hazırlamak için ilk filtreyi cerrahi bıçakla kültür kabından çıkarın, filtreyi filtre tutucusundan kesin ve 5 mL 39 °C'ye ısıtılmış MEM büyüme medyumu ile 50 mM HEPES içeren hazırlanmış 60 x 15 mm'lik plakaya yerleştirin.

Kültür plakasındaki filtreyi sabitlemek için cerrahi bıçağı filtrenin merkezine yerleştirin ve ardından kültür plakasını mikroskobun ısıtmalı tablasına aktarın. Seyreltilmiş DNA'dan iki ila üç mikrolitre miktarını bir mikroenjeksiyon iğnesine yükleyin. İğnenin koruyucu kapağını çevirerek çıkarın ve yere düşmesini sağlayın.

İğneyi tutucuya yerleştirmek için enjektörün menü tuşuna basın ve valfin kapalı olduğundan emin olun. İğneyi tutucusuna vidalayın. İğneyi çok fazla sıkmamaya dikkat edin.

Bu durum kırılmaya yol açabileceğinden, menü tuşuna tekrar basın. Böylece uygulanan dengeleme basıncı, mikroenjeksiyon işlemi sırasında medyanın iğne içine çekilmesini önleyecektir. Son olarak, iğneyi hücrelerin üzerine indirmek için kayıtlı başlangıç konumunu silmek üzere joystick'e dokunun.

10x objektifi kullanın ve iğneyi sıvının üzerindeki ışık demetine getirin. Şimdi hücrelere odaklanın. Odak tekerleğini 180 derece yukarı çevirerek tekrar yukarıya odaklanın ve iğneyi bulun.

İğneyi yavaşça odağa getirin. Ardından tekrar odağın dışına çıkarın. Hücreleri yeniden odağa getirmeye çalışın.

İğneyi tekrar odağa getirin. İğne, ortamın yüzeyine değene ve bu noktada bir hale gözlemlenene kadar işlemi tekrarlayın. Hücrelerin odakta olduğu ancak iğnenin hala odak düzleminin dışında kaldığı için bulanık göründüğü noktaya ulaşana kadar devam edin.

Şimdi 32x objektife geçin ve kaba ayarları yapın. İğnenin ucuyla apikal membrana dokunup yaklaşık 10 mikrometre çıkararak Z limitini belirleyin. Çünkü çekirdekler apikal membranın yaklaşık 10 mikrometre altında yer almaktadır.

Şimdi iğneyi mümkün olduğunca hızlı bir şekilde odak düzleminin birkaç mikron dışına çıkarın. İğneyi çekirdeğin üzerine hizalayın ve joystick üzerindeki enjeksiyon düğmesine basıp bırakın. Uygun enjeksiyon basıncını bulmak için 95 PSI ile başlayın.

Basınç çok yüksek olursa hücreler patlar. Basınç çok düşük olursa beyaz bir nokta kalır ancak başka hiçbir şey gerçekleşmez. Hücre boyutunda bir değişim olmadan, faz değişimini içeren başarılı bir enjeksiyon gerçekleştirin.

Hücrelerin üzerinde bulunan cerrahi bıçağın deliğine 100 ile 500 arasında hücre enjekte edin. Ardından, hücreleri kültür kabı ve cerrahi bıçakla birlikte 39 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve iki saat boyunca inkübe edin. Son olarak, hücreleri 1 mL MEM artı 50 mM 0.1 mg/mL cyclo heximide içeren hazırlanmış 12 kuyucuklu plakaya aktarın ve 31 °C'de iki saat boyunca inkübe edin.

Eksprese edilen GFP sinyalinin solmasını önlemek için, yüzey boyama işleminin sonraki tüm aşamalarında numuneleri alüminyum folyo ile kapatarak ışıktan koruyun. Kültür kabındaki hücreleri buz üzerindeki bir metal plaka üzerine yerleştirin ve yıkayın. Bir kez buz soğuk PBS++ ile yıkadıktan sonra, buz üzerindeki metal plakaya temiz bir parafilm parçası yerleştirin ve ilgi duyulan proteinin ekto domainini tanıyan bir antikordan 30 µL'lik damlalar pipetleyin.

Şimdi, hücreleri içeren filtreyi damlanın üzerine ters şekilde yerleştirin ve filtrenin arka yüzüne birkaç damla antikor ekleyin. Buz üzerinde bir saat inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk PBS++ ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %3 paraformaldehit ile sabitleyin.

Hücreleri bir kez PBS++ ile yıkayın ve beş dakika boyunca PBS++ içinde dengeleyin. Şimdi hücreleri bloklama geçirgen tamponu içinde inkübe edin. Oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, eksprese edilen RAB GTP ACE'yi saptamak için primer antikorları BPB içinde 1:200 oranında seyreltin, 13.000 RPM'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin, ıslak bir hazneye yerleştirilmiş temiz lam üzerine 30 µL antikor solüsyonu pipetleyin.

Hücreleri, antikor damlacıklarının üzerine ters şekilde yerleştirin ve bir saat boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, hücreleri tekrar düz şekilde bir 12 kuyucuklu plakaya yerleştirin ve uygun sekonder antikorlarla inkübasyonu takiben, bir yıkama adımı da dahil olmak üzere, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında BPB ile beş kez yıkayın.

Filtre üzerindeki hücreleri üç kez deiyonize suya batırın ve 10 mikrolitre mount kullanarak mikroslaytlar üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Üzerine 18 by 18 milimetrelik bir mikro lameli kapatın ve yüzey mendilleri kullanarak lamelini hücrelerin üzerine nazikçe bastırın. Son olarak oje ile mühürleyin; yalnızca V-S-V-G-T-S-O 45 GFP kodlayan plazmidin kullanıldığı yalancı enjeksiyonda, protein, iyi polarize olmamış hücrelerdeki kırmızı yüzey boyamasıyla değerlendirildiği üzere, iyi polarize olmuş MDCK hücrelerinin bazolateral yüzeyine iletilir.

GFP füzyon proteininin bir kısmı apikal membrana iletilecektir. Eğer kontrol örnekleri bu şekilde görünüyorsa, verilere güvenilemez ve deney daha iyi polarize olmuş hücrelerle tekrarlanmalıdır. Toplam protein için gözlemlenen yaygın hücre içi yeşil sinyalin de kanıtladığı üzere, 31 °C'deki takip süreci boyunca eksprese edilen tüm GFP füzyonunun bazolateral membrana iletilmediğine dikkat edilmelidir. Bu teknik, geliştirilme aşamasından sonra uzmanlaşıldığında yaklaşık 10 ila 12 saat sürmelidir.

Bu teknik, membran taşınımı alanındaki araştırmacıların polarize epitelyal hücrelerdeki düzenleyici proteinleri incelemelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, mikroenjeksiyon tekniğini kullanarak polarize epitelyal hücrelerde proteinlerin nasıl eksprese edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.