Yaşayan hücreler içinde Subselüler Düzeyinde ve Seconds Zaman ölçeği üzerinde Küçük GTPaz Faaliyet uzay-zamansal Manipülasyon

Bu video, plazma membranındaki bir proteinin aktivitesini manipüle etmek için UV ışığının kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir. Bunu gerçekleştirmek için, hücrelere membran çapalı FRB proteini ile ilgilenilen FK BP füzyon proteini birlikte transfekte edilir. Ortama foto-kafesli bir rapamisin türevi eklenir.

Ardından canlı hücre görüntülemesi sırasında, hücrenin belirli bir bölgesine UV ışığı uygulanır. Rapamisin ve biyotin arasındaki bağ koparılarak kimyasal dimerizatör ve yan ürünü serbest bırakılır; serbest kalan dimerizatör hücrelere difüze olur ve ışınlanan bölgede FKBP ile işaretlenmiş hedef protein ile plazma membranına ankore edilmiş FRB arasında dimerleşmeyi indükler. UV radyasyonu olmadan FKBP ve FRB birleşmez, dolayısıyla herhangi bir etki oluşmaz.

Verilerin analizi, ilgilenilen FKBP füzyon proteininin fizyolojik etkisine bağlı olarak oldukça lokalize bir şekilde toplandığını ortaya koymaktadır. Bu tekniğin farmakoloji ve genetik yaklaşımlar gibi mevcut yöntemlere göre avantajı; etki hızı, hedef özgüllüğü ve uzaysal çözünürlüğün birleşimidir. Bu tekniğin çıkarımları, kanser hücrelerinin göçü sonucunda ortaya çıkan kanser metastazı tedavisine kadar uzanmaktadır.

Bu nedenle, temel migrasyon faktörlerinin aktivitesinin manipüle edilmesi, tedavisi ve iyileştirilmesi için ön koşul olan kesin moleküler mekanizmasını ortaya çıkarabilir. Prosedürü; laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Chris Paul Meyer ve teknisyen Bob de Rose gösterecektir. Bu protokole; steril bir mikro santrifüj tüpünde plazmid DNA, membrana bağlı FRB, floresan işaretli FKBP, TIA one ve deiyonize suyu birleştirerek başlayın, karışıma bir mikrolitre a few gene HD ekleyin ve vorteksleyin.

Tüpü oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, cam sekiz kuyucuklu bir oda sayfasının her kuyucuğuna 50 µL polilizin ekleyin ve yüzeyi kaplamak için bir dakika inkübe edin; ardından çözeltiyi aspire edin ve her kuyucuğun merkezini 50 µL deiyonize su ile yıkayın. Sonrasında, %80 ila %85 konfluens düzeyindeki NIH 3T3 hücreleri tripsinlenir.

Hücreler ayrıldıktan sonra, %10 FBS içeren 10 mililitre DMEM ekleyin, süspansiyondan 375 mikrolitreyi 15 mililitrelik steril bir tüpe aktarın ve üç dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından besiyerini dikkatlice aspire edin. %10 FVS içeren 750 mikrolitre DMEM ekleyin ve resüspande edin.

Pelleti, birkaç kez nazikçe pipetleyerek süspanse edin. Son olarak, hücre süspansiyonunu transfeksiyon çözeltisine ekleyin ve pipet ucuyla nazikçe karıştırarak, her bir kuyucuğa 250 µL hücre transfeksiyon süspansiyonu ekleyin. Sürgüyü kaydırın ve inkübe edin.

15 ila 18 saat boyunca 37 °C'de bekletin. Cage rapamycin, biotin addüktü sentezlemek için; öncelikle steril bir santrifüj tüpünde DMSO içinde 1 mM'lık bir CRB stok çözeltisi hazırlayarak başlayın; ayrı bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 1 mg avadon'u 250 µL PBS içinde çözün.

Ardından, kafesleme birimini rapamisina konjuge etmek için, çözünmüş AVID'ye 0,5 µL CRB stok çözeltisi ekleyin, birkaç kez ters çevirerek karıştırın ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bağlı olmayan küçük molekülleri dışlamak ve CRB AVID konjugesini saflaştırmak için, bir G 25 boyut dışlama kolonunu 300 µL PBS ile dengeleyin.

Kolon dengelendikten sonra beş kez tekrarlayın. Kolonun merkez yatağına 125 µL CRBA çözeltisi yükleyin. Ardından, oda sıcaklığında 800 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüjleyerek çözeltiyi indirin; hücrelerin transfeksiyonunu takiben akış sıvısını 1,5 mL'lik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.

Hücreleri serumla aç bırakmak için besiyerini FBS içermeyen DMEM ile değiştirin ve 12 saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından besiyerini nazikçe aspire edin ve hazırlanan 1 µM CRBA çözeltisinden 250 µL ekleyin. Daha sonra, canlı hücrelerdeki protein dinamiğini görüntülemek için, 365 nm UV LED ışığı için optikleri birleştiren UV aydınlatmalı bir döner disk konfokal mikroskobu kullanın.

Epi-floresan ışık ile. UV ışıkla uyarılabilen floresan boyalarla kaplanmış bir cam plaka kullanarak, aydınlatma noktasının koordinatlarını ve boyutunu belirleyin. Bu, ışınlanacak alanın hassas bir şekilde ayarlanmasına olanak tanır.

Hücrelerin bulunduğu chamber slaytını, 100x objektif ve epi-floresan kullanarak sahneye yerleştirin. Hücreleri odağa getirin ve bir hücre bulun. Görüntüleme için, fizyolojik etkinin arka plan seviyelerini belirledikten sonra hücreleri görüntülemeye başlayın.

Burada, hücrenin seçilen bir kadranına UV ışığı uygulanarak membran kıvrımlanması (ruffling) ölçülür; bu amaçla, kafes yapısı çözülmüş orijinal rapamisin önce DMSO içinde ve ardından PBS ile 400 nanomolar nihai konsantrasyona getirilerek çözülür. Global etkileri indüklemek için görüntüleme odasına çözeltiden 100 mikrolitre ekleyin. RAC'ın lokalize aktivasyonunun lokal kıvrımlanma oluşumunu tetikleyip tetiklemediğini belirlemek için 20 dakika boyunca her 15 saniyede bir floresan görüntüler alın.

NIH 3T3 hücreleri; YFP etiketli RAC aktivatörü FK bp, TIA1 ve membranla ilişkili olan LDR ile transfekte edildi. Sarı daire ile belirtilen hücre kenarındaki FRB lokalize radyasyonun ardından, 1063. saniyeden itibaren bir cıva lambası ile bir saniyelik global aydınlatma uygulandı. Burada görüldüğü üzere, başlangıçta neredeyse hiç membran kıvrımlanması mevcut değildi.

Buna rağmen, lokal aydınlatmanın ardından, global aydınlatma ve FK bp TIA one'ın plazma membranına translokasyonuna neden olan rapamisin eklemesi sonrası mekansal olarak sınırlı ruffling (eteksizleşme) gözlemlenmiştir. Hücre, daha önce gözlemlenen lokal ruffle oluşumunun rack'in mekansal olarak sınırlı aktivasyonundan kaynaklandığını gösteren global ruffle oluşumu sergilemiştir. Kantitatif bir analiz için, hedef hücreler dört kadrana ayrılmış ve bu grafikte görüldüğü üzere, lokal stimülasyonun yanı sıra global stimülasyonun ardından her bir kadrandaki ruffle oluşum frekansı belirlenmiştir.

Gözlemlenen hücrelerin hiçbirinde, UV radyasyonu veya lokal UV radyasyonu olmaksızın ya da dökme ortamda Aden ile veya Aden olmadan uygulanan UV radyasyonu ile CRBA varlığında ruffle oluşumu görülmemiştir. Ancak, CRBA eklendiğinde ve UV ışınlaması yapıldığında, yalnızca birinci kadran ışınlandığında, global radyasyon ile tüm kadranlarda yaklaşık aynı oranda, kabaca %90 oranında ruffle oluşumu görülmüş; buna karşılık ruffle oluşum sıklığı birinci kadranda %100 iken, ikinciden dördüncüye kadar olanle kadranlarda sırasıyla %30, %25 ve %30 olarak gerçekleşmiştir. Bu sonuçlar, rapamisinin lokalize serbest bırakılmasının, tek bir hücrede oldukça lokalize fizyolojik etkiler indüklemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu vakada, rack aktivasyonunun neden olduğu membran kırışıklanması görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, küçük GTPaz aktivitesinin ışıkla uzamsal ve zamansal kontrolünün nasıl sağlanacağı konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu yöntem, belirli proteinlerin plazma membranına translokasyonuna bağımlı olan herhangi bir fizyolojik süreç için uygulanabilir.

Bu prosedür uygulanırken, her işlem için solüsyonların, reaktiflerin ve hücrelerin taze olarak hazırlanmasının önemli olduğunu unutmamak gerekir. UV ışık ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceği ve UV gözlükleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiği unutulmamalıdır.