Manyetik Aktif Hücre Ayırma (LIMACS) kullanarak Lipid veziküllü aracılı Afinite Kromatografisi: Protein-lipit Etkileşim Analiz Roman Yöntemi

Bu deney, lipid bağlayan proteinleri belirlemek ve tanımlanmış bir lipid membran ortamında lipid-protein etkileşimini analiz etmek için tasarlanmıştır. Hücre homojenatındaki proteinler, fosfatidilserin ve seramidden taze hazırlanan lipid vezikülleri ile inkübe edilir. Ardından, lipid vezikülleriyle ilişkili proteinleri manyetik boncuklara sabitlemek için reaksiyon karışımına Xin V konjugatlı manyetik boncuklar eklenir. Son olarak, protein-lipid vezikülleri manyetik aktivasyonlu hücre ayırma yöntemiyle saflaştırılır.

Lipide bağlı protein sonuçlarını tanımlamak için, MDCK hücrelerinde eksprese edilen endojen ve rekombinant atipik PKC'nin ve spesifik bir seramid bağlanma domaininin lize purifikasyonunu göstermek amacıyla SDS-PAGE Western blotting kullanın. Bu yeni tekniğin ELISA veya yüzey bağlanması gibi plazmon rezonans spektroskopisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, lipid-protein etkileşiminin membran benzeri bir ortamda gerçekleştirilmesi ve bağlanan proteinlerin purifiye edilip analiz edilebilmesidir. Bu tekniğin etkileri, fizyolojik lipid-protein etkileşiminin bozulduğu lipidlerle ilişkili hastalıkların tedavisi ve teşhisine kadar uzanmaktadır.

Bu hastalıkların bazılarında protein hedefleri henüz bilinmemektedir ve belirlenmeleri gerekmektedir. Lipid bazlı bir terapi tasarlamak için, 100 µL sical tamponu içinde ekimolar miktarlarda fosfatidilserin ve C16 seramidden oluşan kurutulmuş bir karışımdan hazırlanan lipid SLE'ler ile başlayın. 0,1 mM manganez klorür ile desteklenmiş 300 µL sical tamponu ekledikten sonra bir saat boyunca sonikasyon uygulayın; örnekleri 4 °C'de, 20 dakika boyunca 12.000 ×g'de santrifüjleyin, ardından büyük lipid vezikül peletini 100 µL sical tamponu içinde yeniden süspande edin. Max ayrıştırmasından sonra SLE fraksiyonunun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için 1 nM vibrant cm DII floresan boyası ekleyin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; santrifüjleme ile vibrant cm dai boyalı fosfatidilserin seramid SLE'lerden oluşan pembe bir peleti geri kazanın ve 100 µL tris tamponu içinde yeniden süspande edin.

Ardından, deterjan içermeyen bir hücre lizatı hazırlamak için, hücreleri 10 millimolar tris, hidrojen klorür içeren ve proteaz ile fosfataz inhibitörleri eklenmiş 300 µL hipertonik tampon içerisinde sonikasyona tabi tutun ve santrifüjleyin. Membran kalıntılarını uzaklaştırmak için, şeffaf hücre lizatını lipid fiziksel süspansiyonuna ekleyin ve karışımı 4 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Hücre lizatları fosfoerine sahip endojen membranlar içerebileceğinden, lizatın ek santrifüj adımlarıyla bu membranlardan arındırılması önerilir.

Reaksiyon karışımına 20 µL XNV bağlama tamponu ve XNV konjuge manyetik boncuklar içeren 50 µL çözelti ekleyin; 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin, üretici protokolünde önerilen şekilde manyetik aktive hücre ayırmayı gerçekleştirin. Ardından, bir antikor rekabet deneyesinde lipidlerin varlığını ve miktarını belirlemek için bir mikroplaka floresans okuyucu kullanarak akış yolu ve elüsyon fraksiyonlarındaki canlı CM DII floresansını izleyin. A PKC'nin seramid fosfoserine veziküllerine bağlanma reaksiyonunun özgünlüğünü doğrulamak için, 1 µg anti P KC Zeta tavşan poliklonal antikorunu bir hücre lizatı ile 4 °C'de bir saat boyunca inkübe edin ve ardından lipid vezikülleri ile inkübasyon yapın.

İn vitro lipid protein polarite kompleksi rekonstitüsyonu için maks elüatta ceramide phosphate serin sles'e bağlanan proteinin SDS page ve immünoblot analizi ile devam edin; daha önce gösterilen canlı cm DII boyalı fosfat serian ceramide veziküllerinin pembe pelet hazırlığı ile başlayın, vezikülleri 100 µL tri tamponu içerisinde, 100 µM gamma S GT P, 1 mM GDP ve ilgilenilen rekombinant proteinlerin bir kombinasyonu ile destekleyerek yeniden süspanse edin. Ardından reaksiyonu 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Sonrasında, 20 x stok çözeltideki X in V tamponundan 5 µL ve X in V konjuge manyetik boncuklardan 50 µL ekleyin.

Karışımı, dört derece Celsius'ta 30 dakika daha hafif ajitasyon altında inkübe edin. Çökelmeyi kolaylaştırmak için üretici protokolünde önerilen şekilde NX NV manyetik aktiflendirilmiş hücre ayırımına devam edin. Elüsyon fraksiyonunu 10 mikrogram saf e albumin ile destekleyin.

Proteinleri weyl flue çöktürme ile konsantre edin. Alt faz, zenginleştirilmiş vibrant cm dii içeren kloroform metanolden oluşur. Kahverengimsi ara faz ise manyetik boncukları ve çöktürülmüş proteini içerir.

Weyl flu reaksiyonunun organik kloroform metanol fazındaki pembe, canlı cm dii tespiti ile ellu lipid vezikülleri miktarını belirleyin. Örnekler arasındaki protein miktarlarını normalize etmek için eşit miktarlarda lipid vezikülü kullanın ve SDS page ile analiz edin. İmmünoblotlama.

Tam uzunluktaki PKC Zetta'nın bir yeşil floresan proteine veya bir seramid bağlama alanına C-terminal olarak bağlı olduğu MDCK hücrelerinin deterjansız lizatı. PKC Zetta'nın C terminusü fosfo-serin ile inkübe edilmiştir.

Maks kolonu elüsyonundan sonra seramid vezikülleri, immünoblotlama ile analiz edildi. Seramid bağlayıcı fragman C 20 Zeta, EGFP ve tam uzunluktaki P KC Zeta, lyx prosedürünün özgüllüğü ve etkinliği ile uyumlu olarak maks kolonunun EIT'sinden geri kazanıldı. Fosfatlanmış Suriye seramid veziküllerine bağlanmayan negatif kontrol EGFP, EIT'de tespit edilemedi.

Linx; SDS page, western blotting veya proteomik analiz gibi diğer yöntemlerle tamamlandığında, lipid bağlayıcı protein kompleksinde hangi proteinlerin bulunduğu gibi ek sorular yanıtlanabilir. Geliştirilmesinin ardından LabX, tekil lipid araştırma alanındaki araştırmacıların nöral kök hücrelerde ve epitelyal hücrelerde seramid kaynaklı apoptozu ve hücre polaritesini incelemelerine ön ayak olmuştur.