A β-glucuronidase (GUS) Tabanlı Hücre Ölümü Testi

Bu prosedürün genel amacı, belirli genlerin potansiyel ölüm özelliklerini analiz etmek için bir Gus raporlayıcı sistemi kullanmaktır. İlgili genler bir Gus kasetine klonlanır ve 35 s promotörü altında uygun agrobacterium vektörlerinde büyütülür. Bu vektörler daha sonra Agrobacterium suşu LBA 44 0 4'e transforme edilir ve Nick Oceana Hamana yapraklarına infiltre etmek için bir Gus ekspresyon kaseti içeren kültürle karıştırılır.

Gus aktivitesi, histokimyasal boyama ile görsel olarak veya florimetrik mug deneyi ile nicel olarak değerlendirilebilir. Bu tekniğin, DNA basamaklanması veya tunnel deneyi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı —ki bunlar memeli sistemlerinde yaygın olarak kullanılır ancak bitkilerde tekrarlanması zordur— gas ekspresyonunun gerçekleşmesi için canlı hücrelerin gerekli olduğu basit gerçeğinden yararlanan, hassas ve hızlı, bitki tabanlı bir geçici deney olmasıdır. Bugün prosedürü Hua RAO'lar gösterecektir.

Laboratuvarımızdaki bir doktora sonrası araştırma görevlisi tarafından gerçekleştirilen infiltrasyon işlemi, 25 °C'de yetiştirilmiş üç ila altı haftalık nicotiana hamana bitkilerinin tamamen gelişmiş sağlıklı yapraklarını gerektirir. Bu protokolün sekiz gün boyunca uygulanmasını planlayın. Birinci günde, hücre ölümü analizi için vektörler içeren ve Gus ekspresyon kaseti içeren agrobacterium tumor fassan gliserol stoklarını agar plakalarına ekin; birden fazla kültür kombinasyonu test edildiğinde, negatif kontrol veya dolgu olarak her zaman boş bir vektör ekleyin.

Plakları 28 °C'de iki gün boyunca inkübe edin. Üçüncü günde, her plak üzerindeki tek bir koloniyi 2 mL seçici LB'ye ekleyin. Her bir kültürü, maksimum büyüme yoğunluğuna ulaşana kadar 28 °C'de, 200 RPM hızında çalkalayarak 24 saat boyunca inkübe edin.

24 saatlik inkübasyonun ardından, eğer kümeleşme varsa pipetleme yaparak kültürü tamamen resüspande edin ve Agrobacterium virülans genlerini indüklemek için her bir kültürün toplam hacmini taze selektif LB ile 10 mililitreye tamamlayın. Aseton konsantrasyonunu 25 micromolar olacak şekilde ayarlayın ve her bir kültürü 28 degrees Celsius'de sallamalı inkübatörde 16 saat daha inkübe edin. Bir sonraki adımda, her bir kültürü oda sıcaklığında 4,000 Gs ile 10 dakika boyunca santrifüjleyin ve pelletini 10 mililitre infiltrasyon ortamında resüspande edin.

Aseton eklemeyin, kültürleri tekrar santrifüjleyin, ancak bu kez resüspanse edin. Her bir peleti, 100 micromolar aseton içeren beş mililitre infiltrasyon ortamında süspande edin. Şimdi 600 nanometrede OD değerini ölçün.

0.1 kadar düşük konsantrasyonlar kabul edilebilir, ancak 0.9'dan büyükse, infiltrasyon öncesinde infiltrasyon ortamı ve aseton ile 0.9'a seyreltin. İnkübasyondan sonra kültürleri 28 °C'de, çalkalamalı olarak üç saat daha inkübe edin. Deneysel kültürleri ve kontrol kültürlerini, Gus kasetini içeren kültürle bir bir oranda karıştırın.

Her bir kültür için, ABA sızdırmazlık bölgesini veya yeni çıkan yaprakların alt kısmını infiltre etmek amacıyla bir mililitrelik iğnesiz bir şırınga kullanın. İnfiltrasyon hacmi önemli değildir. Yeterli miktarda eklendiğinde su emilim alanı oluştuğunda, aynı bitkinin karşıt yapraklarına hem negatif kontrolü hem de analiz edilecek geni infiltre edin; ardından iki bitkiyi daha aynı şekilde infiltre edin.

Böylece her kültür için üç tekrarlı bitkiler bulunmaktadır. İnfiltrasyondan üç gün sonra, yaprakların toplanması ve gust protein ekspresyonunun analiz edilmesi zamanı gelmiştir. Tüm yaprağı, tamamen doyurulana kadar xlu substratı ile vakum infiltrasyonuna tabi tutarak histokimyasal analize başlayın.

Şimdi, yaprakları oda sıcaklığında karanlıkta, belirgin mavi boyanma görülene kadar veya gece boyunca inkübe edin. Mavi boyanma belirginleştiğinde, yaprakları distile su ile durulayın ve klorofilleri uzaklaşana kadar gece boyunca %70 ethanol içinde inkübe edin. Ertesi gün, yaprakları distile su ile durulayın ve GUS ekspresyon seviyelerini değerlendirin.

Gus ekspresyonunu nicelendirmek için, bir substrat olan mug, floresan bir ürün olan mu'ya dönüştürülür ve bu ürün ölçülebilir; işlem, infiltre edilmiş yaprak disklerinin sıvı azot kullanılarak bir havanda ezilmesiyle başlar. Ardından, numune buz üzerinde tutulurken 100 µL GUS ekstraksiyon tamponu ekleyin. Şimdi süspansiyonu 4 °C'de beş dakika boyunca 14.000 ×g'de santrifüjleyin ve Gus'ı da içeren toplam çözünür proteinleri barındıran süpernatanı toplayın.

Toplam çözünür protein konsantrasyonunu bir NanoDrop kullanarak ölçün ve konsantrasyonu Gus ekstraksiyon tamponu içindeki her bir örnek için 100 µg toplam protein olacak şekilde ayarlayın. Şimdi, her bir örneğe Gus ekstraksiyon tamponu içindeki mug substratını 2 mM nihai mug konsantrasyonuna ulaşacak şekilde ekleyin. Örnek başına 100 µL toplam hacim yeterli olacaktır; pipetleme ile karıştırın ve reaksiyonu 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Bir saat sonra, 800 µL gusts stop buffer ekleyerek reaksiyonu durdurun. GUS aktivitesini nicelleştirmek için, her örnekten 100 µL bir mikrotitre plakasına yüklenir ve plaka okuyucuda analiz edilir; 365 nm eksitasyon ve 455 nm emisyon dalga boylarında floresan ölçümü yapılır ve bir standart eğri ile karşılaştırılır. GUS aktivitesi, toplam çözünür proteinin her mikrogramı başına dakika başına M mu şeklinde rapor edilebilir. GUS ekspresyon kaseti, hücre ölümü negatif regülatörü veya bir anti-ölüm geni ile birlikte infiltre edildiğinde, kullanılan konstrükte bağlı olarak çeşitli GUS seviyeleri tespit edilir.

Karşılaştırmalı olarak yüksek Gus seviyeleri gözlemlenmektedir. Boş vektör kontrolündeki Gus seviyeleri çok daha düşüktür. Aksine, hücre ölümünün pozitif bir düzenleyicisi veya pro-ölüm geni kullanıldığında, boş vektör kontrolüne kıyasla Gus ekspresyonunda belirgin bir azalma gözlemlenir.

Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yaklaşık bir hafta içinde tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, tekniğin belirli genlerin potansiyelini belirlemek için bir başlangıç adımı olarak kullanıldığının unutulmaması önemlidir. Bu ilk sonuçları doğrulamak ve ilgili hücre tipini belirlemek için ek çalışmalar yapılması gerekmektedir.