İzole, Havalandırmalı ve Enstrumanlı Fare Akciğer Karakterizasyonu Pulsatif Akış ile perfüze

Pulsatil pulmoner basınç akış ilişkilerini incelemek amacıyla. Bu protokol, fare akciğerlerinin nasıl izole edileceğini, ventile edileceğini ve perfüze edileceğini açıklamaktadır. Ventilasyon için trakea cerrahi olarak açığa çıkarılır.

Ardından, pulmoner arter ve sol atrium kanülize edilebilmesi için kalp ve akciğerler izole edilir. Daha sonra pulmoner sisteme perfüzyon uygulanır. Deneyler; pulmoner arter akışının miktarı, dalga formu ve/veya frekansı değiştirilerek gerçekleştirilir.

Elde edilen pulmoner arter ve sol atriyum basınç dalga formları kaydedilir ve pulsatil pulmoner basınç-akış ilişkilerini gösterir. Bu tekniğin in vivo preparatlar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, basınç-akış ilişkilerindeki değişikliklerin; hacim durumu, sempatik sinir sistemi tonusu, aktivite ve anestezi etkileri olmadan elde edilebilmesidir.

Ayrıca, izole akciğer preparatlarının çoğu yalnızca kararlı basınç akış ilişkilerini ölçerken, bizim tekniğimiz pulsatif basınç akış ilişkilerinin belirlenmesine olanak tanır. Bu yöntem, pulmoner vasküler hastalığın pulsatif pulmoner hemodinamiği nasıl etkilediği veya büyük pulmoner arter sertleşmesinin sağ ventrikül sonrası yükünü nasıl etkilediği gibi pulmoner fizyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Kalp ve akciğerlerin açığa çıkarılması ile kanülün pulmoner artere sabitlenmesinin öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.

Enstrümantasyondan kaynaklanan aşırı basınç akciğerlerde ödeme yol açabilir ve hatalı kanül yerleşimi pulmoner arteri delebilir. Deneye başlamadan önce, izole akciğeri ventile etmek ve perfüze etmek için kullanılan IL one sisteminin hazırlanması gereklidir. Borular basınç transdüserlerine bağlanmalıdır.

Tekli pompa ve akış ölçeri kullanarakle sistemi 37 °C'ye ısıtılmış distile su ile tamamen yıkayın ve tüplerdeki hava kabarcıklarını giderin. Ardından, Endur tech pompa tüplerini %1 PBS ile hazırlayın. Şimdi sıfırlama yapın.

İlk olarak her bir P 75 transdüserinin IL 1 sistemine giden valfini kapatıp atmosfere açılan valfini açarak basınç ayarını yapın. Ardından, hayvanı hazırlamadan önce basıncı otomatik olarak sıfırlamak için plug SIS amplifikatörünü kullanın; seramik gözenekli parçayı distile suda bekleterek IO 1 düzeneğini nemlendirin. Fareyi anestezi altına aldıktan sonra, ön pençelerini mantar panoya iğneleyerek cerrahi işlem için sabitleyin.

Şimdi göğüs bölgesini %95 alkol ile püskürtün. Boyun bölgesindeki deriyi tutmak için düz penset kullanın ve düz makasla bir santimetrelik bir açıklık kesin. Boyun içi açığa çıktığında, özofagus ve trakeayı ararken yüzeysel kaslardaki beyaz bez dokusunu kesin.

Yemek borusunu ve trakeayı yanlardaki ve arkadaki dokulardan ayırın ve trakeanın etrafına gevşek bir sütür bağlayın. Trakeayı kanüle etmek için küçük makasla trakeanın bir yanına dikkatlice küçük bir V şeklinde kesi yapın. Şimdi fareyi künt forsepsler yardımıyla IL one sistemine alın.

Trakeal kanülü alın ve trakeanın içine kaydırın. Kanülü bir sütürle sabitleyin. Önce oda havası ile ventilasyona başlayın, göğsü alkolle spreyleyin ve düz pens ile düz makas kullanarak cildi uzaklaştırın.

Sternum boyunca yukarıya doğru cildi kesin. Her iki yandaki cildi kaldırın ve alt kaburgalar hattı boyunca kesin. Şimdi xiphoid çıkıntısını cımbızla kavrayın ve top uçlu makas kullanarak diyaframın sternumun alt kısmıyla birleştiği yerde bir delik açın.

Diyaframı tutun ve kaburgalardan ayırın. Kürel uçlu makas kullanarak kılıç şeklindeki çıkıntıyı (xiphoid process) tekrar kavrayın ve akciğerlere, kalbe veya kan damarlarına zarar vermeden, kürel uçlu makasla sternumu kaburgalar boyunca dikkatlice yukarı doğru kesin. Kalbi açığa çıkarmak için sol kaburgaları tutun ve uçlarını kesin.

Şimdi sağ ventriküle yavaşça 0,1 mililitre heparin enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, kaburgaların geri kalanını kesin. Mikroskop altında kaburgaları keserken, akciğerleri kaburgalardan nazikçe uzaklaştırmak için pensetin arka veya yuvarlak ucunu kullanın. Kalbin üzerindeki yağda bulunan bez dokusunu temizleyin.

Dokuları uzaklaştırmak ve onları kırpmak için cımbız kullanın. Aort ve pulmoner arter etrafına bir sütur yerleştirmek için yaylı makas kullanırken, kalbi küt uçlu cımbızlarla nazikçe destekleyin. Çok az direnç hissedilmelidir.

Şimdi çift düğüm ile gevşek bir sütür atın. Ardından, alt karnı kesin. Kaburgaları ve omurgayı kesmek için açılı makas kullanın.

Bu durum, önemli miktarda kan akışına neden olacaktır. Akışı durdurmak için bir kulak çubuğu kullanın. Kan akışı durduktan sonra, 10 mL RPMI ile doldurulmuş bir şırıngadan dört mL RPMI kullanarak IL sistemini hazırlayın.

Hortumda hava kabarcığı olmadığından iki kez emin olmakta fayda vardır. Şimdi, apeks yakınında küçük bir çentik açıp kanülü yerleştirerek sağ ventrikülü kanüle edin. Pulmoner artere ulaşmak için aşağıya doğru yönelin. Probun ucu, pulmoner arterin neredeyse şeffaf olan duvarı üzerinden görünür olmalıdır.

Ardından, sol ventrikülü kanüle etmek için kanül, aorta ve pulmoner arter etrafındaki sütürü sıkın. Apeks kısmına bir çentik açın ve kanülü sol atriyuma doğru yukarı yönlü olarak yerleştirin. Kapakçığı bulmak için hafif bir basınç gerekebilir, ancak kapakçık bulunduğunda kanül kayarak geçecek ve sütüre gerek kalmadan sabitlenecektir.

Çıkış tüpünde akış görene kadar 10 mililitrelik şırıngadaki RPMI'yı dakikada 0,3 mililitre hızla manuel olarak infüze edin. Çıkış tüpünde akış yoksa, sol ventrikül kanülünü yeniden konumlandırın. Ancak, akciğerlerde akış yoksa, pulmoner arterde muhtemelen bir sızıntı olduğu için deneyi durdurun.

Kalp tamamen kanüle edildiğine göre, 60 mililitrelik şırıngayı IL 1 sistemine bağlayın. Sabit akış pompasını kullanarak RPMI Perfuse 8'i dakikada 1 mililitre hızla infüze edin. İlk perfüzyon sırasında sızıntı olup olmadığını kontrol edin.

Akciğerleri, beyazlaşana kadar iki dakika daha kademeli olarak perfüze edin. Pulsatil akış çalışmaları için; öncelikle tekli pompa piston deplasmanını istenen seviyelere ayarlayın.

Ardından sabit akış hızını ayarlayın. Şimdi osli pompasının vanasını açın ve osli akış profilini çalıştırmadan hemen önce veri kaydını başlatın. İşlemi tamamladığınızda, veri çıktı dosyasını açın ve ilk denemeden elde edilen deneysel akışlara dayanarak deneysel akışı grafiğe dökün.

Q max istenilen düzeyde olacak şekilde, her frekanstaki osilatuvar pompa piston yer değiştirmesini ayarlayın. Havalandırmayı sabit bir basınçta tutun. Sabit akış denemeleri için veri toplama sırasında, tekil pompaya giden valfi kapatın ve sabit akış hızını istenilen seviyeye ayarlayın. Verileri kaydetmeye başlayın ve sabit akış protokolündeki adımları takip edin.

Her deneme arasındaki her akış hızında en az 10 saniye boyunca veri toplayın. Akış hızını tekrar 0,5 milliliters per minute değerine ayarlayın. Veri toplama sırasında ventilasyonun sabit bir basınçta tutulduğundan emin olun.

Sıfır sol atriyal basınç denemeleri isteniyorsa, denemeler sırasında çıkış borusunu çıkarın. Hava yolu borusundaki RPMI'yı dikkatle izleyin. RPMI'nın hava yolu basınç dönüştürücülerine ulaşmasına izin verilmemelidir, aksi takdirde bu cihazlar zarar görecektir.

Burada, üst satırda akış hızı Q ve ikinci satırda çeşitli koşullar altında ortaya çıkan pulmoner arter ve sol atriyum basınçlarının sabit akışlı perfüzyon sonuçları yer almaktadır. İlk iki panelde, çıkış tüpü yerinde olduğu için sol atriyum basıncı Q ile birlikte artmış ve azalmıştır; birinci panel ekspiryum sonu hava basıncını, inspiratuar basıncı ve ikincisi ekspiryum sonu hava basıncını göstermektedir. Ardından, sol atriyum basıncının sabit kalması ve Q'dan bağımsız hale gelmesi için tüp çıkarılmıştır. Daha sonra, sol atriyum basıncının daha yüksek olması için çıkış tüpünün yüksekliği manuel olarak ayarlanmıştır.

Ancak tekrar Q'dan bağımsız olarak, ilk panel son ekspirasyon basıncını ve inspirasyon basıncını, ikinci panel ise son ekspirasyon basıncını göstermektedir. Her bir durum için ortaya çıkan kararlı pulmoner arter basınç-akış ilişkileri, basıncın akışa karşı grafiğe dökülmesiyle elde edilebilir.

Üst panelde akış Q ile yapılan pulsatil akış perfüzyonunun sonuçları ve buna bağlı olarak gelişen pulmoner arter, sol atriyum ve hava basınçları görülmektedir. Alt panelde ise, bu pulsatil pulmoner basınç-akış ilişkilerinden, toplam sağ ventrikül sonrası yükünü yansıtan pulmoner vasküler empedans hesaplanabilir.

Bu teknik ustalığa erişildiğinde 20 ila 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, ellerinizin titrememesi için acele etmemeniz ve rahat olmanız önemlidir. Akciğerler yeterince perfüze edildikten sonra, zor kısım bitmiş demektir.

Bu prosedürün ardından, pulmoner pulsatil basınç akış ilişkilerinde gözlemlenen değişikliklerden sorumlu olan moleküler mekanizmalar nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla akciğer dokusu üzerinde histoloji veya biyokimyasal analizler gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu teknik, pulmoner fizyoloji alanındaki araştırmacıların, genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak pulmoner vasküler hastalığın gelişimi ve ilerlemesinde spesifik genlerin ve proteinlerin rolünü araştırmalarının önünü açmaktadır.