Elastomerik PGS Arter Doku Mühendisliği Yapı iskeleleri

Bu video, arteriyel doku mühendisliği için gözenekli tübüler iskelelerin nasıl üretildiğini ve bunların dinamik mekanik koşullandırmaya nasıl tabi tutulduğunu göstermektedir. Bu işlem, öncelikle biyobozunur bir elastomer ve ısı birleştirme yöntemi kullanılarak iskelelerin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından iskeleler, hücre ekimi için hazırlanır ve bir biyoreaktör sistemine monte edilir.

Biyoreaktörde vasküler düz kas hücreleri iskelelere ekilir ve kültüre edilir. Haftalar sonra doku hasat edilir ve taramalı elektron mikroskobu, H ve E boyama ile elastin otofloresansı kullanılarak analiz edilir. Elde edilen düz kas hem çok katmanlıdır hem de dik yönelimlidir.

Partikül ağartma gibi mevcut tekniklerin temel avantajı, gözenekli tübüler iskele ve hyaluronik asit üretmek için cam kalıp kullanmaktır. Kalıp uzaklaştırıldığında, iskele kalıbı bir cam tüp parçasıyla hazırlanır. Tüpü bir tutucuya yerleştirin ve bir gün önce hazırlanan hyaluronik asit çözeltisini tüpün içine dökün.

Hiyalüronik asit iç duvar boyunca yavaşça aşağı akar. Kalıbın tabanına ulaştığında, kalıbı ters çevirin. Kalıbın iç duvarı çözelti ile eşit şekilde kaplanana kadar bu adımı tekrarlayın.

Kaplamadan sonra, hazırlanan tüm cam kalıpları bir vakum fırınında 37 °C'de 24 saat boyunca kurutun. Genellikle, cam kalıplar kururken eş zamanlı olarak dört kalıp hazırlanır. Tuz partikül dökümlerini hazırlayın, SVE tuz partiküllerini 25 ila 32 µm boyutuna gelene kadar öğütün.

Ertesi gün; hazırlanan cam kalıp mandreni, PTFE tüp, ısı ile büzülür kılıf ve PTFE halkayı birleştirin. İlk olarak, mandreni 65 millimeter uzunluğundaki PTFE tüplerin içine yerleştirin ve 120 °C'de beş dakika boyunca fırınlayın. Beklerken PTFE'yi büzmek için bir hibridizasyon inkübatörünü 37 °C'de en az 30 dakika boyunca önceden ısıtın.

Tüpler mandrelleri çevreledikten sonra, ısı ile daralan kılıfı mandrel üzerinde serbestçe hareket edecek şekilde itin. Ardından mandreli cam kalıbın içine yerleştirin ve A-P-T-F-E halkasını mandrelin altına takın. PTFE halkasının cam kalıbın tabanına sıkıca oturduğunu kontrol edin.

Ardından, bir spatula ve silikon kauçuk huni kullanarak cam kalıba tuz partikülü bulamacı ekleyin. Daha sonra, partiküllerin eşit dağılımı için kalıba spatula ile hafifçe vurun ve fazla tuzu sıyırın. Şimdi ısıtılmış inkübatörü kapatın ve tuzla doldurulmuş kalıpları hızlıca içine yerleştirin; tuz sonraki 30 dakika boyunca kaynaşacaktır, bunun ardından kalıpları 37 °C'de 24 saat boyunca vakumlu fırında kurutun.

Soğutma işleminin ertesi günü, PTFE halkayı sabitleyerek paslanmaz çelik mandreli iterek kalıplardan çıkarın. Gerektiğinde kargaburun pense kullanın. Ardından, PTFE halkayı kalıbın alt kısmından çıkarın.

Ardından, kılıfın büzülmesi için kalıpları fırınlayın ve büzülmüş kılıfları kalıplardan çıkarın. Kalıpların kullanılana kadar soğumasını bekleyin ve bir çeker ocak içindeki desikatörde saklayın. Bir damlalık kullanarak cam kalıpları 45 derece açı yapacak şekilde eğin ve kalıbı yavaşça döndürürken iç lümenine PGS çözeltisi damlatın.

PGS çözeltisinin kalıp duvarı boyunca aşağı doğru aktığından emin olun. Kuru bir nokta varsa, daha fazla PGS ekleyin. Şimdi THF'nin çeker ocakta en az 30 dakika boyunca buharlaşmasına izin verin. THF tamamen uçtuktan sonra, kalıpları vakumlu fırında kürleyin.

Bir gün boyunca kürledikten sonra, kalıpları oda sıcaklığına kadar soğutun ve 24 °C sıcaklıktaki deiyonize suya yavaşça, dikey olarak daldırın. Kalıpları çok hızlı eğmek, iskeleyi yırtan hava kabarcıkları oluşturur. Kalıpları dikkatlice su banyosuna aktarın.

Silikon bir tüp kullanarak bunları açılı bir şekilde konumlandırın ve hyaluronik asidin bir saat boyunca çözünmesini bekleyin. Bir saatin sonunda hyaluronik asit kalıptan ayrılmadıysa, kalıp hâlâ daldırılmış durumdayken bir spatula yardımıyla hyaluronik asidi her iki uçtan yavaşça itin ve ardından kalıbı hafifçe sallayın. Şimdi, iskelelerin cam kalıbın içinde hareket edip etmediğini kontrol edin; eğer hareket etmişlerse, iskeleyi kalıptan çıkarmak için pens ile yavaşça çekin.

Ardından, hassas iskeleleri nazikçe karıştırarak deiyonize su banyosuna dikkatlice aktarıp tuz partiküllerini yıkayarak uzaklaştırın. Bu işlem en az üç gün sürecektir ve suyun günlük olarak değiştirilmesi gerekir. Tuzun tamamı uzaklaştırıldıktan sonra, her bir iskeleyi deiyonize su ile doldurulmuş 15 milliliter'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir saat boyunca kuru buz kutusunda dondurun. Donmuş santrifüj tüplerini, kapakları açık şekilde üç gün boyunca bir liyofilize cihazına yerleştirin.

Dondurularak kurutulan iskeleleri, kullanılana kadar bir desikatörde saklayın. İskeleleri 25 ila 30 milimetre uzunlukta keserek başlayın. Ardından, her bir tıpanın orta deliklerinden PTFE tüpler geçirerek iki silikon kauçuk tıpa hazırlayın.

Ardından, hs ring'den bir buçuk milimetrelik parçalar kesin ve bu parçalardan birini iskelenin bir ucuna kaydırın. Tıpaa bağlı bir PTFE tüpü, iskeleyi tübe sıkıca bağlamak için HS ring'in altında kalacak kadar bir örtüşme sağlayacak şekilde iskelenin aynı ucuna itin, HS ring'i bir fırında daraltın ve düzeneğin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Şimdi, biyoreaktör odası görevi gören 50 milimetrelik bir polikarbonat tüp iskelenin üzerine geçirilir ve silikon kauçuk tıpanın iç yüzeyine sabitlenir.

Tıpkı daha önce yapıldığı gibi, başka bir PTFE tüp ve tıpa, hazneyi tamamlamak için bir hs halkası ile iskelenin diğer ucuna sabitlenir. İkinci tıpa, polikarbonat tüpün diğer ucuna takılır. Ardından, tıpaların dış yüzeyleri iki alüminyum alaşımlı plakaya sabitlenir.

Her bir plakanın yan deliğinden iki adet dişli çubuk geçirin ve plakaları başparmak vidalarıyla sabitleyin. İskele yapısını biyoreaktöre takın. Şimdi, iki hs halkası arasındaki mesafe olan her bir iskeletin görülebilir uzunluğunu ölçün ve iç yüzey alanlarını hesaplayın.

Hücre ekimi için. Bir otoklavda, biyoreaktör ünitesinin her bir parçasının yanı sıra folyoya tek tek sarılmış olan odacıkları sterilize edin. Sterilizasyon sonrası, biyoreaktörü bir hücre kültürü kabininde monte edin.

İskeleyle, akış devresinde bir peristaltik pompa kullanarak dakikada bir milimetre hızında bir dizi perfüzyon ile ön işlem yapın ve durulayın. İşleme sırasıyla %70 etanol, %50 etanol ve ardından %25 etanol ile birer saat durulayarak başlayın. Bu üç etanol durulamasını, iki saatlik bir PBS durulamasıyla takip edin.

Son olarak, biyoreaktörü 24 saat boyunca SMC kültür ortamı ile perfüze edin; bu sürenin ardından reaktör, hücre ekimi ve deneyler için hazır hale gelecektir. Şimdi, ekteki el yazmasında yer alan talimatları izleyerek, biyoreaktöre santimetrekare başına 2 milyon hücre ekleyin ve sonraki 21 gün boyunca tüp ortamlarını değiştirip pompa hızında ayarlamalar yapın. Konstrüktteki basınç, kültürün ilk günündeki yaklaşık 4 mmHg değerinden, iki haftalık kültür sonrası 100 mmHg'nin üzerine kademeli olarak çıkacaktır; üç haftalık kültür süresinin sonunda, hücreleri hasat edin ve ekteki el yazmasında belirtildiği şekilde analiz için hazırlayın.

Bu tübüler PGS iskeleler, tuz füzyon yöntemiyle üretilmiştir. Taramalı elektron mikrografları, tüm iskelelerin homojen duvar kalınlıklarına sahip olduğunu ve kesitlerinde herhangi bir kısmi kusur bulunmadığını göstermiştir. Tüm iskelelerin lüminal yüzeyinde rastgele dağılmış makro ve mikroporlar gözlemlenmiştir.

Hücre kültüründen sonra, çok katmanlı SMC'ler akış yönüne dik bir oryantasyonla büyümüştür. Ayrıca, hücreler ve DCM proteinleri tüm PGS konstrüktlerinin lümenini tamamen kaplamıştır. Elastin otofloresansı da konstrüktün lüminal yüzeyinde çevresel olarak organize olmuş elastik fiberlerin varlığını göstermiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, gözenekli tübüler iskale nasıl yapılacağını, hücrelerin nasıl gözlemleneceğini ve önceden tasarlanmış biyoreaktör kullanılarak iskalenin nasıl kültüre edileceğini anlamış olmalısınız.