ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Bu prosedürün genel amacı, yara iyileşmesine yardımcı olmak için kök hücrelerin iletilmesinde ve farklılaştırılmasında kullanılabilecek, doğal biyomalzemelerden yapılmış kompozit bir matris oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle bir deney hayvanından adipoz kaynaklı kök hücrelerin veya bir SC'nin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, A SC'ler önceden hazırlanmış kitosan mikroküreler üzerine yüklenir.

Ardından FİBRİLLİ kolajen jel dökülür ve A-S-C-C-S-M boncukları kolajen jel üzerine tabakalar halinde yerleştirilir. Son olarak, A-S-C-C-S-M kolajen jel üzerine PEG fibrin jel dökülür ve besiyeri eklenir. Nihayetinde, A SC'nin CSM boncuğundan hem kolajen hem de PEG fibrin matrislerine çift yönlü eşzamanlı migrasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu prosedür aracılığıyla, tek bir kök hücre kaynağı kolajen ve PEG fibrin mikro çevrelerinden farklı farklı uyarılar alabilir ve pleiotropik faktörler üretmek ve ön vasküler yapıların bir ağını oluşturmak için farklı şekilde stimüle edilebilir. Bu tekniğin, tek materyalli kompozitler veya deselülerize deri ikameleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, diğer ürünlerin konakçı tarafından ürünün revaskülarizasyonunu aktif olarak ele almamasıdır. Bu yöntemle ilgili ilk fikrimizi, izole RAD A SE'nin domuz fibrin matriksinde kültüre edildiğinde vasküler bir fenotipe doğru diferansiye olma eğilimi olduğunu fark ettiğimizde edindik.

Bu gözlem, tek bir kök hücre kaynağının, farklı biyomalzemelerden oluşan bir sistemde eş zamanlı olarak kullanılabileceği fikrini ortaya çıkarmıştır. Adipoz kaynaklı kök hücrelerin veya ASC'lerin izole edilip kültüre alınması, kitosan mikrokürelerin veya CSM'lerin hazırlanması ve ASC'lerin CSM'lere yüklenmesinin ardından, süksinil glutarat modifiyeli peg'in dört mililitre tris tamponlu salinde çözülmesiyle polietilen glikol, fibrin hidrojeli hazırlayın. Deneyden hemen önce, çözeltiyi sterilize etmek için 0,22 mikronluk bir filtre kullanın.

Altı kuyucuklu bir plakanın kültür kuyucuğunda, 500 µL fibrinojen stok ve 250 µL PEG stok karıştırıp %5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de 20 dakika inkübe edin. Ardından, önceden hazırlanmış 250 µL A-S-C-C-S-M'yi pegillenmiş fibrinojen çözeltisiyle karıştırın, hemen 1 mL trombin stok çözeltisi ekleyin ve bir pipet kullanarak hızlıca bir veya iki kez trite edin; hücre-jel karışımını derhal 12 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve %5 CO₂ nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. Sonrasında, elde edilen peg fibrin'i iki kez HBSS ile yıkayın ve %10 FBS ile desteklenmiş alpha minimal essential medium ile %5 CO₂ nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de inkübe ederek 11 günlük bir süre boyunca standart ışık mikroskopisi tekniklerini kullanarak takip edin.

Hücrelerin CSM'den, iki normal sodyum hidroksit kullanılarak sıçan kuyruk tendonlarından ekstrakte edilen tip bir kollajen içeren A-S-C-C-S-M jel karışımına göçünü gözlemleyin. pH değerini 6.8'e ayarlayın ve fibrilleyin. Fibrillenmiş kollajen A-S-C-C-S-M karışımını 12 kuyucuklu bir plakaya ekleyin ve %5 carbon dioxide nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 degrees Celsius sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.

Fibrilasyonun tamamlandığını kontrol ettikten sonra, kollajen A-S-C-C-S-M jellerini 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 11 güne kadar inkübe edin. Tek bir kök hücre kaynağının migrasyon ve ko-indüksiyon özelliklerini incelemek amacıyla çift katmanlı konstrükt geliştirmek için, hücrelerin CSM'den jel içerisine migrasyonunu standart mikroskopi tekniklerini kullanarak 11 günlük süre boyunca gözlemleyin. İki biyoiskelele kullanın.

Hem kolajen hem de PEG fibrin jellerini şu küçük modifikasyonlarla hazırlayın: 7.5 mg/mL konsantrasyonda bir mililitre kolajen hazırlayın. Ardından karışımı altı kuyucuklu bir doku kültürü insertine aktarın ve 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Fibrilasyon tamamlandıktan sonra, kolajen yüzeyine kültür ortamı içinde 5 mg A-S-C-C-S-M içeren 200 µL ekleyin.

Mikrosferler jel üzerinde çöktükten sonra, 250 µL hücre kültür ortamı kullanarak PEG fibrin jelini hazırlayın. Ardından, pegillenmiş fibrinojen trombin solüsyonunu A-S-C-C-S-M kolajen tabakalarının üzerine katmanlar halinde ekleyin. İşlem tamamlandığında, tam oluşumu sağlamak için konstrüktleri %5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.

Son olarak, konstrüktün üzerindeki üst bölmeye bir mililitre besiyeri ve alt bölmeye üç mililitre besiyeri yerleştirin. Bu iskele içine gömülmüş bir SC'nin karakterizasyonu, SC yüklü CSM'lerin bir kolajen tabakası ile peg fibrin tabakası arasına sıkıştırılabileceğini ve yeni koşulları altında gelişmek için her iki hücre dışı ortamdan eş zamanlı ve farklı şekilde sinyaller alabileceğini ortaya koymuştur. Burada gösterildiği gibi kolajen, yeşil renkteki stro one ekspresyonlarının yanı sıra fibroblast benzeri morfolojileri ile kanıtlandığı üzere, ASC'lerin kök hücre olarak kalma yeteneklerini desteklemiştir.

Buna karşılık, PEG fibrin, burada gösterilen lümenli tüp benzeri morfolojileri ve kırmızı ile gösterilen endotelyal hücreye özgü von Willebrand faktör ekspresyonları ile kanıtlandığı üzere, ASC'lerin avasküler fenotipe doğru farklılaşmasını tetiklemiştir. Ayrıca, burada gösterildiği gibi, gözlemlenen bu fenotiplerin kültürün erken evrelerinde ortaya çıktığı ve 11 gün boyunca korunduğu görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, sıçan adipoz kaynaklı kök hücrelerin nasıl izole edileceği, kito-mikrosferlere nasıl yükleneceği ve FDA onaylı biyomalzemeler kullanılarak çift katmanlı bir hidrojele nasıl entegre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu protokolde kullanılan biyomalzemelerin ve hücrelerin hayvan ve insan kaynaklı olduğunu ve konakçılarından gelen patojenlerle kontamine olmaları durumunda son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürler gerçekleştirilirken kişisel koruyucu donanım ve aseptik hücre kültürü teknikleri gibi önlemler her zaman alınmalıdır.