Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

Benim adım Jiang; Harvard ve MIT sağlık, bilim ve teknoloji alanlarında poster bursiyeriyim. Bu laboratuvardaki uzmanlığım kapsamında, hücresel davranışı incelemek için özgün mikroakışkan cihazlar geliştirebiliyorum. Çok özgün gradyan cihazlarının yanı sıra, mikroakışkan cihazlar için entegre sistemler de geliştirebilirim.

TC cihazı, hücre-hücre etkileşimini, hücre etkileşimini ve hücre-solar faktör temasını hassas bir şekilde manipüle edebilir. Bu nedenle, TC sistemini kullanarak temel hücre biyolojisini anlamanın yanı sıra gelişim biyolojisi ve kök hücre biyomühendisliği alanlarında uygulamalar yapabiliyorum. Benim adım Amir Manchi; Harvard, MIT Sağlık Bilimleri ve Teknoloji Bölümü'ndeki Profesör Haan laboratuvarında lisans öğrencisiyim.

Mikroakışkan cihazlar üzerine çalışıyorum ve mikroakışkan cihazların hücre kültürü yapmak ve toksisite çalışmaları gibi farklı araştırmalar yürütmek için büyük potansiyel taşıyan araçlar olduğunu bir prensip kanıtı olarak göstermeye çalışıyoruz; ayrıca bu cihazlar içindeki akış karakterizasyonunu akış hızları, geometri ve diğer çeşitli parametrelerin bir fonksiyonu olarak incelemeye ve optimize etmeye çalıştık. Şu an mikrofabrikasyon odasından başlıyoruz ve yapacağımız şey, bazı mikroakışkan cihazlar üretmek; mikroakışkan cihazları gerçekleştirmek için bazı silikon gofret kalıplarına ve bunların üzerinde bazı PDMS kalıplara ihtiyacımız var. Bu PDMS polimeri aslında iki farklı maddenin karışımıdır.

Bu, silikon elastomer baz ve silikon elastomer kürleme ajanının bir karışımıdır. Bu ikisini, 10 birim baz ve 1 birim kürleme ajanı olacak şekilde 10'a 1 oranında karıştırıyoruz. Şimdi buraya yaklaşık 20 gram baz almak istiyorum.

Ayrıca iki gram kürleme ajanına da ihtiyacım var ve kürleme ajanının yoğunluğu çok daha düşüktür. Çok daha hızlı akacaktır, bu yüzden biraz dikkatli olmam gerekiyor. Şu an yaklaşık 22 gram oldu ve şimdi bazı (baz) ile kürleme ajanını birbirine karıştırmak istiyorum.

Bunun için bir pipet kullanacağım. Karışımı mümkün olduğunca çok iyi karıştırmaya çalışacağım. Bu PDMS polimerini, üzerinde aslında desenler bulunan silikon gofretlerin üzerine dökmek istiyorum; silikon gofret, PDMS kalıpların desenlenmesine yardımcı olur.

Burada iki adet silikon gofret olduğunu fark edebilirsiniz; bunun nedeni, birinin mikro akışkan cihazımızın üst katmanı, diğerinin ise alt katmanı için olmasıdır. Mikro akışkan cihazlarda iki katmana ihtiyaç duyarız çünkü içeride bir kanal oluşturmaya çalışıyoruz ve mikro akışkan cihazların temel mantığı, bu kanalların içinde bir akış sağlamaktır. Karışımın içinde çok fazla kabarcık olduğu için bu karışımı her iki silikon gofretin üzerine dökmem gerekiyor.

Bu kabarcıkları çıkarmak istiyorum ve bunun için vakum kullanıyoruz. Tekrar ana laboratuvar alanındayız; daha önce belirttiğim gibi, PDMS karışımının içinde çok sayıda kabarcık var ve bunları gidermek istiyoruz. Karışımları vakum odası içindeki silikon gofretlerin üzerine yerleştireceğim. Odayı kapatıp vakumu başlatacağım; bu işlem tamamlandıktan sonra, PDMS kalıpların daha katı hale gelmesi için onları gece boyunca bir fırında bekleteceğiz.

Tamam, şu an laboratuvardayız ve bu mikro akışkan cihazları monte etmek istiyoruz. Yapacağımız işlem, gece boyunca inkübatörde kalan ve silikon gofretler üzerindeki desenleri oluşturmuş olan PDMS kalıpları almak olacak; burada iki farklı desen kullanacağım. Sol tarafta, üst katman olacak mikro kanalı görebilirsiniz ve sağ tarafta ise alt katman olacak bazı yeşil çizgi desenlerini görebilirsiniz.

Ve bu, mikro cihazın içindeki olukları oluşturacak. Üst katmanın silikon gofretten kolayca ayrılabilmesi için bu jelleri kesmeye başlıyorum. Ardından, desenler yukarı bakacak şekilde, bunları yüzeyleri yukarı gelecek biçimde bu petri kabına aktaracağım.

Yeşil çizgi desenleri olan oluklar için de aynısını deneyeceğim. Bunlar alt tabakayı oluşturacak. Jel kesildikten sonra onu petri kabına aktaracağım ve desenlerin üzerine toz gelmesini önlemek için üzerlerini bantlayacağım.

Bir sonraki adım, hücrelerin ve medyumun giriş çıkışını sağlamak için kanalların uçlarını delmektir. Burada geniş bir yüzey olduğu ve desenleri kendi başıma göremediğim için, kanalları görebilmek adına bunu kullanacağım ve her iki ucu da deleceğim. Bir tarafa, rezervuar oluşturabilmek için büyük bir delik açacağım; diğer tarafa ise polietilen tüpler kullanabilmek için küçük bir delik açacağım.

Şu anda mikrofabrikasyon odasındayız ve bir sonraki adım, elimizdeki iki farklı yüzeyi birbirine yapıştırmaktır. Bunu yapmak için plazma temizleyici olarak adlandırılan bu makineyi kullanıyoruz ve bu işleme plazma işlemi denir. Bu haznenin içinde plazma ortamı oluşturulur ve plazma-yüzey etkileşimi sırasında plazma, zayıf yüzey bağlarını kırarak bunların yerine yüksek derecede reaktif kimyasal gruplar yerleştirir.

Şimdi yapılacak işlem, toz oluşumunu önlemek amacıyla buraya yerleştirilen bantları çıkarmak ve ardından bu kalıpları haznenin içine yerleştirmektir. Kapıyı tamamen kapatacağım, önce gücü ve ardından pompayı açacağım; böylece hazır olacağız. İşleme beş ila 10 dakika sonra devam edeceğiz.

Şimdi sistemi kapatmak istiyorum, bu yüzden pompayı ve gücü kapatıyorum ve ardından hazneyi açıyorum. Aslında burada negatif bir basınç var, bu nedenle bir ses duyabilirsiniz. Bunun sebebi negatif basınçtır, bu yüzden kalıplarımı yavaşça dışarı çıkarıyorum.

Her iki desenli yüzey de yukarı baktığı için, alt katmanı sol elime alacağım; üst katmanı ise ters çevirip kanallarımın üzerine yerleştireceğim ve ardından katmanları birbirinin üzerine bastıracağım. Yapışma gücü ve kalıcılık, bu plazma işlem makinesini kullanmanın avantajıdır. Şu anda burada gördüğünüz üzere, üst katmandaki kanalı ve alt katmandaki oluklu desenleri görebiliyorsunuz ve bir sonraki adım için hazır durumdayız.

Ardından bu kültür odasını, bu kültür besiyerini getirin ve kapaklı kabın kapağını açın. Daha sonra fibronektini yükleyebiliriz; 60 µL fibronektin alıp cihaza yükleyin. Kanal içindeki fibronektinin ince bir tabaka halinde kaplanmasını sağlamak için cihaz içerisinde bir akış oluşturmak amacıyla çıkıştan hafifçe vakum yapabiliriz.

Ardından bu cihazı inkübatöre yerleştirebiliriz ve bir saat bekleriz. Bir saatlik inkübasyonun ardından, inkübatörün içindeki titreşimi durdururuz. Örnekleri inkübatörden çıkarırız ve ardından üç adet fiber fırça kullanırız. Süspansiyonu hazırlayıp hücreleri çöktürdükten sonra medyumu ekleriz ve son olarak bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımı yaparız.

Genellikle cihazın içinde milyonlarca hücrenin bulunmasını sağlarız. Bu nedenle, disosiyasyon işleminden sonra, birkaç kez şampuan itip ardından hücre süspansiyonunu alabilir ve kanala yükleyebiliriz; hücreleri kanalın içine daha iyi yüklemek için aspiratör kullanarak nazikçe akış sağlayabilirsiniz.

Süpernatant medya ve yüzey süspansiyonu çıkış hücresi aracılığıyla genellikle otomatik olarak aspire edilir, biliyorsunuz, seçici global kanal ekimi yapılır. Bundan sonra, hücreler kanal içerisinde tamamen yayılana kadar cihazı söküp bir saat boyunca inkübatöre yerleştirebiliriz. Ardından, annexin V ve propidyum iyodürün yanı sıra hidrojen peroksit infüze edebiliriz.

Ardından zaman hipotezi analizini inceleyin. Örneği bir doku kültürü kabı içerisinden alabiliriz ve ardından 2 ml DMEM medyumunun yanı sıra 20 µL annex V, 40 µL propidium iyodür ve 100 mM hidrojen peroksit ile çözeltiyi hazırlayabiliriz. Sonrasında annex V, propidium iyodür ve hidrojen peroksit içeren 2 ml medyumla birlikte şırıngayı yerleştirin.

İki mL besiyeri ve beş mL propidyum iyodür, hidroperoksit ekleyin. Çözeltiyi şırıngaların içine koyup hava kabarcıklarını giderdikten sonra C-bear'ı bağlayabiliriz. Bunlar sızdırmaz Hamilton warm mill şırıngalarıdır.

Bu, üç ayı. Bu, tek kullanımlık tavan tavanları. Bu, 27 gauge iğne.

Bu, PE 20 polietilen tüptür. Çözeltiyi şırıngaya yükledikten sonra, birkaç kez tam olarak itebilirsiniz; ardından bazen şırınga ucuna hafifçe vurarak hava kabarcıklarını çıkarabilir ve çözeltiyi geri çekebilirsiniz. Bir kez daha, tamamen itin, hava kabarcığını giderin ve ardından nazikçe tekrar doldurun.

Bir öğün için çözeltiyi alın ve ardından valfi değiştirebiliriz. Çözeltiyi üç yollu valften ve tamamen tüplerin içinden itin. Son olarak çözelti, tüplerimizin ucundan dışarı çıkar ve ardından tüpü mikro cihaza bağlayıp dakikada bir mikro litre infüzyon yapmaya başlayabiliriz.