MG53-aracılı Hücre Zarı Tamiri Görselleştirme In vivo Ve In vitro Sistemleri

Bu prosedürün genel amacı, hem canlı hayvanda hem de izole hücrelerde membran onarım kapasitesini değerlendirmektir. İzole iskelet kas lifleri toplanır ve FM 1 43 boyası içeren ortamla çevrelenir. Daha sonra, boyanın hücre içine girişini sağlamak amacıyla hücre membranının bir kısmını ışınlayıple hasar vermek için bir UV lazer kullanılır.

İzole edilmiş hücreler, hücrenin plazma membranına ve sitozolüne yerleşecek olan GFP MG 53 eksprese eden plazmid DNA ile transfekte edilir. Ardından, hasar oluşturmak amacıyla bir mikro elektrot ucu C two C 12 membranına yerleştirilir. Nihayetinde, GFP MG 53'ün hasar bölgesine translokasyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Mikro elektrot penetrasyonu ve kas lifi izolasyonu tekniklerinde uzmanlaşmak için gereken uygulamalar sebebiyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürü; laboratuvar yöneticimiz Dr. Lin, doktora sonrası araştırmacı Dr. Wazu, lisansüstü öğrencimiz Matt Orange ve bölümümüzdeki araştırma doçenti Dr. Shazale gösterecekler. Başlamak için, deney sırasında hayvanlardan gelecek atıkları toplamak amacıyla koşu bandının altına bir tepsi veya mavi laboratuvar pedi yerleştirin.

Ardından, koşu bandı yüzeyinin açısını ayarlayın. Bazı koşu bantlarında eğimi ayarlamak için entegre bir mekanizma bulunurken, bazılarında koşu bandının başka yöntemlerle yükseltilmesi gerekir. Genellikle düz bir yüzey veya yokuş aşağı veya yokuş yukarı 7 ile 15 derece arasında bir açı kullanılır.

Fareleri, elektrikli ızgara kapalı ve bant tahrik motoru açıkken ancak bant hareket etmiyorken koşu bandına yerleştirerek alıştırın; 15 dakikalık alışma süresinden sonra motivasyonel elektrikli ızgarayı açın. Koşu bandını yaklaşık beş metre/dakika başlangıç hızıyla çalıştırın. Hızı her dakika bir ila iki metre/dakika artırarak hayvana beş dakikalık bir ısınma süresi tanıyın.

Test sırasındaki uyumu artırmak için bu ısınma süresini üç ila 10 gün boyunca her gün tekrarlayın. Akut bitkinlik egzersizi gerçekleştirmek için, maksimum hıza ulaşana kadar koşu bandının hızını zamanla artırın ve bitkinlik belirtilerini izleyin.

Bir hayvan, zamanın yarısından fazlasını koşu bandı dışında veya beş saniye üst üste ızgara üzerinde geçirdiğinde tükenmiş sayılır. Tükenmiş fareyi çıkarın ve toplam koşu süresini kaydedin. Dayanıklılık eğitimi.

Koşu protokolleri aynı ısınma prosedürü ile başlar. Ancak, maksimum hız genellikle daha düşüktür ve koşu süreleri oldukça uzun olabilir. Testten sonra fareleri kendi kafeslerine geri koyun ve koşu bandını %70 ethanol ile temizleyin.

İleri analizler için ayaktaki flexor digitorum brevis kasının yüzeysel tabakasını izole edin. İlk olarak, alttaki kasa zarar vermemeye dikkat ederek ayak tabanının derisini orta hat boyunca kesin. Ardından, yatay kesikler atarak deriyi çıkarın.

Calcaneus kemiğine tutunmuş olan FDB kasının yassı beyaz tendonunu tanımlayın. Tendonu tutunma bölgesine yakın bir yerden ayırmak ve ardından kesmek için pens kullanın. Bağ dokularını temizlerken tendonu nazikçe yukarı çekin.

Distal tendonların tekil parmaklara ayrıldığı noktayı belirleyin. Tendonları, daha derin kas tabakasına bağlandıkları yerden kesin ve FDB'yi çıkarın. FDB kas demetini, 37 °C'ye önceden ısıtılmış bir mililitre kollajenaz çözeltisinin içine yerleştirin.

Tüpü 37 derece Celsius'lik bir orbital çalkalayıcıya yatay olarak bantlayın ve 65 dakika boyunca 200 RPM hızında çalkalayın. Yeterli sindirim, parçalanmış görünüm ve soluk renk ile belirlenir. Sindirilmiş demetin geçişine izin vermek için bir mililitrelik bir pipet ucunun ucunu kesin.

Demeti, yaklaşık 600 µL 2.5. Kalsiyum tiro içeren bir santrifüj tüpüne kolayca aktarın. Gevşek liflerin demetten ayrılması için tüpü nazikçe ters çevirerek sallayın.

Ardından, 30 µL'lik bir pipet ucunun ucunu, çapı kas demetinden sadece biraz daha küçük olacak şekilde kesin. Bu ucu, demeti pipete çekmek ve ardından tekrar çözeltinin içine itmek için kullanın. Liflerin çoğunluğu demetten ayrılana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Tüpü nazikçe çevirerek ayrıştırılmış fiberleri karıştırın. İstenilen miktarı alıp cam tabanlı delta T tabağına damlatın. Kalan fiberleri, kullanım ve ek çalışmalar için yaklaşık altı saat boyunca dört derece Celsius'ta saklayın.

Kabın beş dakika boyunca kıpırdatılmadan bekletilmesine izin verin. Bu, fiberlerin kabın cam tabanına yapışmasını sağlar. Cam tabanlı kabı, UV lazerle donatılmış bir konfokal mikroskoba yerleştirin.

Normal bir striyasyon paterninin varlığını ve düz, çubuk benzeri bir şekli kontrol etmek için fiberleri 100 x'ten daha büyük bir büyütmede faz kontrast mikroskobunda gözlemleyin. Çözeltiye, final konsantrasyonu 2.5 micromolar olacak şekilde FM 1 43 veya FM 4 64 styro perineum boyaları ekleyin. Hasar oluşturmak için fiberi, görüş alanının sol üstünden sağ altına doğru 45 derecelik bir açıyla konumlandırın.

Plazma membranının beş çarpı beş piksellik bir alanını ışınlayın. Maksimum güce ayarlanmış bir UV lazeri beş saniye boyunca uygulandığında, ışınlanan bölge plazma membranını bölmelidir; beş çarpı beşlik kutunun yarısı fiberin içinde, geri kalanı ise fiberin dışında olmalıdır. Boyanın fibere girişini, beş dakikaya kadar her beş saniyede bir görüntülüleyin. Floresan boya zamanla fiber içine endositoz edileceği ve veri analizini karmaşıklaştıracağı için, kap başına yalnızca üç fiber ışınlanabilir.

Üç fiber kullanıldıktan sonra yeni bir kap hazırlanmalıdır. Fiberler arası karşılaştırma yapmak için analiz yazılımı kullanarak, yaklaşık 200 kare mikronluk bir alandaki floresans yoğunluğu değişimini hesaplayın. Her kare için delta F bölü F sıfır şeklinde şu hesaplama yapılmalıdır; burada F sıfır, yakalanan ilk karedeki ilgi alanının ortalama floresansı, delta F ise sonraki her karedeki floresans değişimidir.

GFP MG 53 eksprese eden plazmid DNA ile hücreleri transfekte etmek için standart yöntemleri kullanın. Ardından mikro pipetleri hazırlayın. Bir mikro pipete Pyrex kapiler yerleştirin.

Önceden ayarlanmış programa göre çekme ve çekme işlemleri gerçekleştirilir. Mikro pipet, üç eksenli bir mikro manipülatör kültürüne takılır. Delta T kabındaki ortam uzaklaştırılır ve yerine 2,5 millimolar kalsiyum tiro tamponu eklenir.

Transfekte edilmiş hücreleri içeren kap, 40 x 1.3 NA yağ daldırma objektifli bir lazer taramalı konfokal mikroskoba yerleştirin. Mikro pipeti hücre membranına yerleştirip ardından hızla geri çekerek hücrede akut canlı hücre hasarı oluşturun. Troponin kaynaklı membran bozulması için kare başına 1,54 saniye aralıklarla ardışık canlı hücre görüntüleri toplayın.

Görüntülenen hücrenin tam üzerine, dakikada yaklaşık bir mililitre hızla %0.005 troponin PERFÜZYONU yapın. Koşu kapasitesindeki azalmayı ölçmek için koşu bandı kullanılabilir. Burada görülen MG 53 nakavt fareler, iskelet kasındaki hasar nedeniyle azalmış koşu kapasitesine sahiptir.

UV lazerin neden olduğu hasarın boyutu, görülen fiberin membran onarım kapasitesine bağlıdır. Burada normal bir fareden alınan, hasar öncesi bir fiber görülmektedir. Bu görüntü 200 saniye sonra yakalanmıştır ve hafif bir hasarı göstermektedir.

Membran onarım kapasitesi bozulmuş MG 53 nakavt farelerinden türetilen bir kas lifi, hasar sonrası daha belirgin boya girişine sahip olacaktır. Burada, hasarsız bir GFP MG 53 transfect edilmiş C two C 12 miyotüp örneği verilmiştir. Bu görüntüdeki ok, hasar bölgelerine doğru hareket eden GFP MG 53 içeren vezikülleri göstermektedir.

Bu örnekte, plazma membranına zarar vermek için saponin kullanılmıştır. Yaralanma sonrası GFP MG 53'ün sitozolden hücre membranına translokasyonuna dikkat ediniz. Bu prosedürü uygularken, pürüzsüz saralemembranlara ve net çizgilenme modellerine sahip kaliteli kas liflerinin izole edilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu videoyu izledikten sonra, kasın membran onarım kapasitesinin ve kültürlenmiş hücrelerin nasıl değerlendirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.