ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doğal bir membran ortamındaki proteinlerin, transmembran domainlerinin veya TMD'lerin ligamanlaşma eğilimlerini incelemektir. Bu işlem, ilgilenilen transmembran domaininin e coli'de, periplazmaya lokalizasyon için maltoz bağlayıcı protein ile kimerik bir protein olarak ve transkripsiyonel bir raporlayıcı olarak tox R ile eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir; transmembran domaininin tetiklediği ligamanlaşma, tox R'nin dimerleşmesiyle ve LXi transkripsiyonunun aktivasyonuyla sonuçlanır. İkinci bir adım olarak hücreler lize edilir ve beta galaktoz tarafından ışığı soğuran tür olan O nitrofenolata veya ONP'ye hidrolize edilen ONPG ile işleme tabi tutulur.

Ardından, 405 nanometredeki ışık absorbansı ölçülerek ONP seviyeleriyle nicelleştirilir. Transmembran domain seviyelerini belirlemek amacıyla, ligasyon sonuçları bir tox R reporter analizi temelinde transmembran domainlerin ligasyon eğilimini ortaya koyar. Bu tekniğin SDS page veya floresans gibi mevcut biyofiziksel yöntemlere göre temel avantajı, transmembran domainin davranışının, deterjan miselleri gibi bir membran mimetik sistem yerine e coli içinde ekspresyon yoluyla doğal bir fosfolipid çift katmanında incelenmesidir.

Bu yöntem, membran proteinleri alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, transmembran heliks etkileşiminde yer alan temel yapısal özelliklerin aydınlatılması gibi. Bu protokole başlamadan önce, NHE1 ve BMH1 kısıtlama bölgeleriyle çevrelenmiş ilgili TDS'yi temsil eden ticari olarak sentezlenmiş oligonükleotidlerden, gerekli kimera proteinlerini eksprese eden yedi plazmit hazırlanır. Plazmitler hazırlandıktan sonra, fhk 12 kompetan hücrelerini buz üzerinde yavaşça çözdürün. Çözündükten sonra, hücreleri 15 ml'lik kültür tüplerine aktarın; her bir tüpe 200 ng plazmit DNA ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Ardından hücrelere 42 °C'de 90 saniye boyunca ısı şoku uygulayın, bunu takip eden iki dakika boyunca buz üzerinde inkübasyon yapın; 800 µL SOC medyumu ekleyin ve örnekleri 37 °C'de çalkalayarak bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, her bir örnek için üç tekrarlı olacak şekilde 15 mL'lik kültür tüpleri kullanarak, kloramfenikol ve ampicillin içeren 5 mL LB medyumu ile 50 µL transformasyon karışımını inoküle edin. Son olarak, örnekleri 37 °C'de çalkalayarak 20 saat boyunca inkübe edin. Tüm ligasyonun ölçümü için TDS beta galaktosidaz aktivitesi belirlenir.

Öncelikle, plak okuyucuyu 28 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun. Yazılı protokolde açıklandığı şekilde, taze Z tampon çözeltileri hazırlamak için Z tampon stok çözeltisini kullanın. Z tampon kloroformu tüpten rezervuara aktarın; bu sırada Z tampon kloroformunun sadece üstteki sulu tabakasını pipetlediğinizden emin olun.

Hatasız pipetleme sağlamak için 96 kuyucuklu plakayı üzerine ızgara çizilmiş bir kağıdın üzerine yerleştirin; her bir kuyucuğa 100 µL Z buffer kloroform, ardından her bir kültürden dörtlü tekrarlar halinde beş µL ekleyin. Boş olarak kullanılacak dört kuyucuğa kültür eklemeyin. Hücre yoğunluğunu belirlemek için plakanın OD 595 değerini ölçün.

Plakadaki tüm kuyucuklara 50 µL Z buffer SDS ekleyin. Ardından, hücreleri liz etmek için plakayı plaka okuyucuda 10 dakika boyunca sallayın; hücre lizinden sonra tüm kuyucuklara 50 µL ONPG için ZPA ekleyin. Plakayı plaka okuyucuya geri yerleştirin ve 20 dakika boyunca her 30 saniyede bir OD 405 değerini ölçün.

Boş kontrolle normalize ederek Miller birimleri hesaplaması yoluyla beta laktosidaz aktivite seviyesini belirleyin. Konstruktlar arasında eşdeğer protein ekspresyonunu doğrulamak için Western blotting uygulanır. İlk olarak, üç paralel kültürden 50 µL'yi birleştirin ve ardından örnekleri bir mikrosantrifüj kullanarak santrifüjleyin.

Süpernatanı pipetleyerek uzaklaştırın ve yeniden süspande edin. Kalıntı peleti iki katlı örnek yükleme tamponunda çözün; her bir örnekten 7,5 µL'yi standart %8'lik bir jele yükleyin ve elektroforezi 125 V'da bir saat beş dakika boyunca gerçekleştirin. Transferden sonra membranı, kimera proteini görselleştirmek için anti M-V-P-H-R-P konjuge antikor ile inkübe edin; kimera protein yaklaşık 70 kDa'da gözlemlenir ve bazen 48 kDa civarında bazı degradasyon ürünleri görülebilir.

Endojen MVP ayrıca 45 kilodaltonda da gözlemlenmektedir. Kimera TMD konstrüktünün membrana uygun şekilde yerleştiğini değerlendirmek için, maltoz bağlayıcı protein eksikliği olan PD 28 hücre hattı kullanılır; tek karbon kaynağı olarak maltoz içeren minimal besiyerinde büyütüldüğünde, yalnızca periplazmada doğru konumlandırılmış maltoz bağlayıcı proteine sahip membran integral bir ekspresyon ürünü eksprese eden hücreler büyüyebilir. PD 28 hücrelerini fhk 12 hücreleri için açıklandığı gibi transforme edin ve iki mililitre LB besiyerine inoküle edin.

İnkübasyon sonrası hücreleri 37 °C'de, 300 RPM çalkalamayla gece boyunca büyütün. Hücreleri santrifüj ederek çöktürün ve iki mililitre PBS içinde resüspansiyon yaparak geniş uçlu bir pipetle nazikçe pipetleyerek yıkayın. Çöktürme işleminden sonra, hücreleri PBS ile ikinci kez yıkayın, ardından son bir santrifüj işlemi gerçekleştirin ve bir mililitre PBS içinde resüspansiyon yapın.

Minimal medyuma inokülasyon yapmak için resüspande edilen hücrelerin 25 µL'sini kullanın. Hücreleri 37 °C'de, çalkalamalı olarak 15 saat boyunca inkübe edin. Her örnekten 200 µL'yi bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın ve plaka okuyucu kullanarak OD 595 değerini ölçün.

Bu işlemi 25 saate kadar her iki saatte bir tekrarlayın. Çoklu geçişli membran integral proteini latent membran proteini bir'e ait her bir transmembran domainin ligamentleşme eğilimi, tox R transkripsiyonel raporlayıcı testi kullanılarak analiz edilmiştir. Transmembrane domain beş, pozitif kontrol olan ve dimerleşme dizisi olarak iyi bilinen GPAA ile karşılaştırılabilir şekilde, yüksek Miller birimleri ile kanıtlandığı üzere güçlü bir ligamentleşme eğilimi göstermektedir.

Transmembran domain beş D1 50 A'daki zararlı bir mutasyon, sekansın LMP1'e bağlanma yeteneğini azaltır; TM1 önemli ölçüde bağlanma göstermez ve transforme edilmemiş FHK 12 hücreleri olan boş örneğin sinyalinin hemen üzerinde, çok düşük bir Miller birimi sinyali sergiler. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen bir transmembran heliksin doğal bir membran ortamında yüksek dereceli kompleksler oluşturma yeteneğine sahip olup olmadığının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu prosedürü uygularken, büyük hatalardan kaçınmak ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için 96 kuyucuklu plakaya son derece dikkatli pipetleme yapmak önemlidir.