Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

Bu prosedürün genel amacı,le sitozole giren toksin havuzunu tespit etmek ve miktarını belirlemektir. Bunu başarmak için, toksin önce 4 °C'de konakçı hücrenin yüzeyine bağlanır. Ardından bağlanmamış toksin uzaklaştırılır ve hücreler 37 °C'ye ısıtılır; bu işlem toksinin endomembran sistemine ve ardından konakçı sitozolüne hareket etmesine olanak tanır. Hücre permeasyonunu takiben, plazma membranını seçici olarak permeabilize etmek için digitonin kullanılır.

Hücre ekstraktları, son bir adım olarak diferansiyel santrifüjasyon kullanılarak ayrı membran ve sitozolik fraksiyonlara ayrılır; sitozolik fraksiyonun antitoksin antikoru ile kaplanmış bir SPR sensörü üzerinden perfüzyonu yoluyla sitozole toksin girişini tespit etmek ve miktarını belirlemek için yüzey plazmon rezonansı (SPR) kullanılır. Bu yöntem, toksinin sitozole giriş verimliliği ve kinetiği, sitozole giren toksin miktarı ve toksinin sitozole taşınmasının olası ilaç inhibisyonu gibi toksin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu protokole başlamadan önce, HeLa hücrelerinin gece boyunca inkübasyonunun ardından, yazılı protokolde açıklandığı şekilde hücre toksikasyonu için HeLa hücrelerini hazırlayın.

Kültür ortamını, mililitrede 100 nanogram Ganglioside GM1 içeren bir mililitre DMEM ile değiştirin ve 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bu işlem, kolera toksini için bağlanma bölgelerinin sayısını artırır. Toksinin GM1 reseptörü, GM1 çözeltisine maruz kalan hücrelerin plazma membranına yerleşecektir.

Bir saatlik inkübasyonun ardından, besiyeri içeren GM'yi uzaklaştırın ve hücreleri iki kez DMEM ile yıkayın. Ardından, mililitrede bir mikrogram kolera toksini içeren bir mililitre DMEM ekleyin ve hücreleri 30 dakika boyunca dört derece Celsius'ta bekletin. Toksin içeren besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri iki kez yıkayın.

Ardından hücreleri, 1 mL DMEM içerisinde 37 °C'de istenen süre boyunca inkübe edin. Her takip periyodunun sonunda, hücreleri PBS ile yıkayın ve ardından her kuyucuğu 250 µL 0,5 mM EDTA ve PBS ile inkübe edin. Buz üzerinde 10 dakikalık inkübasyonun ardından, hücreleri P 1000 pipet ucu ile güçlü şekilde tritüre ederek altı kuyucuklu plakadan uzaklaştırın.

Hücrelerin bulunduğu bir kuyucuk toplandıktan sonra, bu örnek aynı koşula sahip ikinci ve ardından üçüncü kuyucukla birleştirilir. Daha sonra, üç tekrarlı kuyucuktan elde edilen birleştirilmiş hücre süspansiyonu tek bir mikro santrifüj tüpüne yerleştirilir. Şimdi, mikro santrifüj tüpünü bir masaüstü mikro santrifüjde beş dakika boyunca döndürün.

Tüm koşullar için yaklaşık olarak aynı boyutta hücre peletleri elde etmek amacıyla 5,000 ×g'de santrifüj yapın. Süpernatanı uzaklaştırın ve ardından hücre peletini, önceden hazırlanmış ve soğutulmuş 100 µL %0,04'lük digitonin çalışma çözeltisi içinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin; ardından bir masaüstü mikro santrifüj kullanarak, digitonin ile geçirgen hale gelmiş hücreleri 16,000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Süpernatan fraksiyonunu içerenle sitozolu yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve organel içeren pelet fraksiyonunu saklayın. SPR toksin standartları, HCN tamponu içerisinde 110, 1 ve 0,1 ng/mL konsantrasyonlarda hazırlanır; örnekler, sitozol içeren süpernatan fraksiyonlarının HCN tamponu ile 1 mL son hacme seyreltilmesiyle hazırlanır. Enjeksiyondan önce 500 µL'lik örnek döngüsündeki havanın tamamen tahliye edildiğinden emin olmak için en az 1 mL örnek hacmi gereklidir. Organel içeren pelet fraksiyonları, %1 Triton X 100 içeren 1 mL HCN tamponu içerisinde yeniden süspande edilir.

Membranla çevrili toksin havuzunu serbest bırakmak için deterjan eklenmesi gereklidir. Ayrıca, fraksiyonlama prosedürünün doğruluğunu onaylamak amacıyla kontrol deneyi için paralel sitozolik ve organel fraksiyonları setleri hazırlayın; sitozolik fraksiyonu 20 µL dört x örnek tamponu içinde, organel fraksiyonunu ise 120 µL bir x örnek tamponu içinde yeniden süspande edin. Her bir fraksiyonun eşdeğer hacimlerini sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi ile ayırın ve sitozolik bir proteinin süpernatan fraksiyonda ve çözünür bir resident ER proteininin pelet fraksiyonda ayrıştığını göstermek için Western blot analizi ile problayın. SPR lamını hazırlamak için önce, kendi kendine düzenlenmiş bir tek tabakaya sahip altın kaplama cam lamı SPR cihazına yerleştirin.

Sensör lamı üzerinden 41 microliters per minute akış hızında 10 dakika boyunca E-D-C-N-H-S çözeltisi perfüze ederek lamı aktive edin. Sonraki tüm perfüzyonlarda aynı akış hızını kullanın. Plakayı 0.05%2020 içeren PBS ile beş dakika boyunca yıkayarak E-D-C-N-H-S aktivasyon tamponunu uzaklaştırın.

Plaka, E-D-C-N-H-S çözeltisi ile kapakların kaldırılması sonucunda artık reaktif MI bağlayıcılar içermektedir. Ardından, 20 milimolar sodyum asetat içerisinde 1/20.000 dilüsyonda hazırlanan bir anti CTA antikorunu, aktive edilmiş sensör lamı üzerine 15 dakika boyunca perfüze edin. pH değişimi nedeniyle, kısaca RIU olarak adlandırılan kırılma indisi biriminde başlangıçta bir düşüş görülecektir.

Ardından, antikorun amit reaktif bağlayıcılar tarafından yakalanmasıyla RIU değerinde bir artış görülecektir. Sensör lam üzerindeki bağlanmamış antikorları, beş dakikalık bir PBST yıkamasıyla temizleyin. Yakalanan antikor tarafından üretilen RIU sinyali düzleşip stabilize olacak ve böylece yeni bir bazal sinyal sağlanacaktır.

Slayt hazırlığının son aşaması olarak, sensör slaytı üzerinden beş dakika boyunca bir molar etanolamin PERFÜZE edin. Bu işlem, sensör slaytında kalan bağlanmamış tüm bağlayıcıları kapatır ve etkisiz hale getirir. RIU sinyali artacaktır; bir temel okuma oluşturmak için antikor kaplı sensör üzerinden beş dakika boyunca PBST perfüze edin.

Ardından, sensör üzerinden 300 saniye boyunca deneysel bir örneği veya toksin standardını perfüze edin. Ligandı tampondan çıkarın ve sensör üzerinden 200 saniye daha PBST perfüze edin. Sensöre bağlı kalan tüm toksinler, pH 5.0'da PBST ile yapılan 102. yıkama ile uzaklaştırılır.

Bu işlem, sinyali başlangıçtaki baz hattı okumasına geri döndürerek aynı sensör üzerinde başka bir örneğin işlenmesine olanak tanır. Yeni bir örnek yüklemeden önce, önceki örnekten kalan sıvıları dışarı atmak için örnek döngüsünden küçük bir miktar hava geçirin. Veri toplama işleminin ardından.

Veriler scrubber two yazılımı ile analiz edilebilir ve şekil hazırlama işlemleri için Igor yazılımı kullanılabilir. Pertussis toksini, a zinciri sitozole girmeden önce hücre yüzeyinden ER'ye hareket eden bir AB toksinidir. PTs birimi sitozole girer.

SPR tabanlı translokasyon analizi, intoksike edilmiş CHO hücrelerinin sitozolündeki PT'leri tespit edebilmiştir. İntoksike edilmemiş hücrelerin sitozolünden herhangi bir sinyal oluşmamış olup, bu durum anti-PT'lerin doğruluğunu kanıtlamıştır. Bir antikor, konak sitozolünün herhangi bir bileşeniyle çapraz reaksiyona girmemiştir.

Felden varlığında toksinle maruz bırakılan hücrelerden elde edilenle sitozol fraksiyonu. A da pozitif bir sinyal üretmemiştir; BFA, toksinin ER translokasyon bölgesine taşınmasını ve dolayısıyla H zincirinin sitozole iletilmesini engeller. Chole toin, ER'ye transloke olan bir başka AB tipi toksindir.

CT ile işlem görmüş helo hücrelerininle sitozolik fraksiyonunda CTA birim tespit edilmiştir. Bu durum, metodolojinin birden fazla hücre tipiyle çalıştığını ve anti zincir antikoru mevcut olan herhangi bir toksine uygulanabileceğini vurgulamıştır. CT ile işlem görmüş hücrelerin sitozolik fraksiyonu, anti CTB antikoru ile kaplanmış bir SPR sensörü üzerinden perfüze edildiğinde herhangi bir sinyal tespit edilmemiştir; böylece CT A biriminin aksine, hücreye bağlanan CTB PENTAMER'in sitozole girmediği gösterilmiştir.

Anti-CTA antikoru ile kaplanmış bir SPR sensörü üzerindeki profüzyonu takiben; organel fraksiyonundan gelen sinyal,le sitozolik fraksiyondan gelen daha zayıf sinyale kıyasla ölçeğin dışındadır. Bu durum, CT'nin ER translokasyon bölgesine taşınmasındaki bilinen yetersizlikle tutarlıdır ve bu yetersizlik, sitozole ulaşabilen toksin miktarını sınırlar.

Transloke olan sitozolik toksinin zamana bağlı birikimi de izlenebilir. Hücrelerin 4 °C'de CT'ye maruz bırakılmasının ardından, 37 °C'ye ısıtmadan 15 dakika sonra sitozolde herhangi bir toksin tespit edilmemiştir.

37 °C'de 30 dakika sonra küçük bir sitozolik toksin havuzu saptanmış ve 45 ile 60 dakikalık takip aralıklarından sonra sitozolik toksinin giderek daha büyük miktarları tespit edilmiştir. Bu durum, hücreyle ilişkili toksinin konak sitozole sürekli ve uzun süreli bir şekilde iletildiğini göstermektedir. Analiz, toksinin sitozole translokasyonunun inhibisyonunu da tespit edebilmektedir; %10 DMSO ile işlem görmüş hücreler, toksinin açılmasına kıyasla, işlem görmemiş toksine maruz bırakılmış kontrol hücrelerine göre düşük düzeylerde sitozolik CT tespit etmiştir.

Bir zincir, sitozole translokasyon için ön koşuldur; bu nedenle DMSO ile indüklenen CT A1 stabilizasyonu, buna bağlı olarak proteinin ER'den sitozole hareketini engellemiştir. Toksin translokasyonunun DMSO ile indüklenen blokajını nicelleştirmek için, toksinin bilinen konsantrasyonlarından oluşturulan bir standart eğri kullanılarak sitozolik CT A1 konsantrasyonu, işlem görmemiş hücreler için 0,3 ng/mL ve DMSO ile işlem görmüş hücreler için 0,1 ng/mL olarak hesaplanmıştır. DMSO'nun CT A1 açılmasını inhibe etmesi, böylece CT A1'in ER'den sitozole translokasyonunda üç katlık bir azalma meydana getirmiştir.

Bu prosedürün ardından,lezyon aktivitesi ilele sitozolde bulunan toksin miktarı arasında doğrudan bir bağlantı kurmak için toksisite analizleri gibi diğer tekniklerden yararlanabileceğiz.