Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının

Bu video, kimyasal kütüphanelerin yüksek kapasiteli taraması veya kimyasal ya da çevresel ajanların spesifik protein aktivitesi üzerindeki etkisini değerlendirmek amacıyla çevresel kirleticilerin tespiti için floresan CL gans suşlarının kültürü ve dağıtımıyla ilgili bir yöntemi göstermektedir. CL elgan'da, önce solucanlar için besin olarak bakteriyel kültürler hazırlanır ve GFP transgenik senkronize solucanlar kültüre edilir.

Ardından 0,5 ila 2 milyon solucan toplanır, yıkanır ve 3 adet 84 kuyucuklu mikrotitrasyon plakasına paylaştırılır; daha sonra kimyasal bir kütüphaneden alınan küçük moleküller veya su, gıda veya toprak gibi test örnekleri solucanlara eklenir. Son olarak, solucanların floresan seviyeleri bir mikroplaka okuyucu ile ölçülür.

Floresans yoğunluklarının veri analizi, indüklenebilir transkripsiyonel yolları modüle eden veya çevresel kirleticilerin tespitine olanak tanıyan küçük moleküllerin ortaya çıkarılmasını sağlar. Bu tekniğin, in vitro ve hücre kültürü tabanlı assayler gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, in vivo ortamda toksik veya inaktif olan bileşiklerle zaman kaybının önlenmesidir. Bu yüksek kapasiteli yöntem, çeşitli indüklenebilir yolları modüle eden küçük moleküllerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem küçük molekül kütüphanelerinin yüksek verimli taraması için geliştirilmiş olsa da, gıda ve çevresel örneklerdeki kontaminanların biyosensörle tespitinde de uygulanabilir. Prosedür, laboratuvarım teknikeri Andrew Dine ve laboratuvarım doktora sonrası araştırmacısı Q long tarafından gösterilecektir. Bakteriyel solucan yemini önceden hazırlayın.

500 mililitre, mililitre başına 50 mikrogram streptomisin ile desteklenmiş terrific broth'un, beş mililitre doygun e coli OP 50 ile inokülasyonu yaparak başlayın. Kültürü bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 37 °C'de gece boyunca büyütün.

Ertesi gün, kültürü 10 adet 50 mililitrelik tüpe bölün. Ardından tüpleri soğutmalı bir santrifüje yerleştirin ve 2, 500 RCF hızında 20 dakika boyunca döndürün. Döndürme işleminin ardından, her bir bakteri peletini 10 mililitre sıvı nematod büyüme besiyerine veya NGM'ye resüspande edin.

Süspansiyonları yatay olarak çalkalayın. Bakterileri yeniden süspande etmek için 15 dakika boyunca orbital çalkalayıcı kullanın. Ardından, bakteri kültürünü 4 °C'de 20 dakika boyunca 2,500 RCF'de santrifüjleyin.

NGM'yi dekante edin ve bakteri peletini tartın. Ardından, eşit hacimde NGM tamponu ekleyin ve peletleri vorteksleyerek yeniden süspande edin. Son olarak, yeniden süspande edilen bakteri kültüründen üç mililitreyi 15 mililitrelik tüplere paylaştırın ve ihtiyaç duyulana kadar minus 20 degrees Celsius'ta saklayın.

Bu gösterimde, stres indükleyen Xeno Duke kredisinin transkripsiyon faktörü Sskn one üzerindeki etkisi bir örnek olarak ölçülecektir. Sskn one'ın, oksidatif ve xenobi stresleri sırasında sitoprotektif genleri aktive ettiği bilinmektedir. İki floresan konstrükt taşıyan Trenchgenic c gans hattı VP 5 96'nın büyük ölçekli bir kültürü hazırlanır.

VP 5 96 solucanları, transkripsiyon faktörünün aktivitesini izlemek için kullanılan GFP'yi yönlendiren GST dört promotörü ile Sskn bir ve solucan sayısı normalizasyonu için standart olarak kullanılan RFP'yi yönlendiren DOP üç promotörünün her ikisini de eksprese eder.

DOP three, bir dopamin reseptörü promotörüdür ve vücut genelindeki nöronlarda konstitütif olarak eksprese edilir. Örnekte, ksenobiyotik maddelerin sskn one'ı güçlü bir şekilde aktive ettiği ve GS T four promotöründen eksprese edilen GFP miktarını artırdığı göz önüne alındığında, kültürleri hazırlamak için 150 milliliters N NGM tamponu, 1.5 milliliters LB, 150 microliters 1 molar kolesterol ve 75 microliters 100 milligrams per milliliter Streptomisin'i birleştirerek başlayın. LB eklemek, solucanların cam ve plastik malzemelere yapışmasını önlemeye yardımcı olur, ancak bu miktar bakteriyel büyümeyi desteklemek için yeterli değildir.

Karışımı sterilize etmek için filtreleyin, ardından bir litrelik steril bir erlene aktarın ve GR yetişkin solucanlarından yumurtaların salınması için erleni kenara alın. Solucanları santrifüjleyerek ve süpernatant berraklaşana kadar NGM besiyerini yenileyerek bakterileri solucanlardan yıkayın. Solucanları steril suda yeniden süspanse ederek ikinci kez yıkayın ve santrifüjleme işleminin ardından tekrar santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve tüpü 3,75 mililitre steril su ile doldurun. Bir mililitre ev tipi çamaşır suyu ve 250 mikrolitre 10 normal sodyum hidroksit ekleyip tüpü hemen beş ila altı kez tersyüz ederek karıştırın. Solucanlar çamaşır suyuna dört dakika boyunca maruz kaldıktan sonra tüpü bir rotatora yerleştirin.

Tüpü bir stereo mikroskobun altına yerleştirin. Yetişkinlerin çoğu lizis olmuş olmalıdır. Lizis gerçekleştikten sonra kalan yetişkin solucanların lizisine yardımcı olmak için tüpü 15 ila 20 kez kuvvetlice sallayın; toplam beş dakika tamamlandığında, tüp dolana kadar steril su ekleyin.

Yumurtaları toplamak için tüpü beş altı kez alt üst ederek karıştırın. Tüpü 500 RCF'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Yumurtaları, 10 mililitre steril su içerisinde yeniden süspanse ederek, santrifüjleyip süpernatantı uzaklaştırarak üç kez yıkayın.

Ardından, 100 µL'lik yumurta örneğini 10 mL NGM tamponu ekleyerek 100 kat seyreltin. Daha sonra, mikroskop altında bir Petri kabı kapağına beşer µL'lik üç alikot pipetleyin. Üç ayrı beş µL'lik alikottaki yumurta sayısını sayın.

Toplam yumurta sayısını tahmin etmek için, NGM tamponu içeren erlene 200.000 ile 2 milyon arasında yumurta ekleyin ve kültürü 20 °C'de 100 RPM hızında çalkalayın. Yumurtalar erlene eklendikten en az 16 saat sonra, süspansiyon halindeki solucan kültüründen yaklaşık 0,5 mL almak için steril serolojik pipet kullanın.

Steril bir Petri kabı kapağına üç adet beş µL damla pipetleyin. Solucanları felç etmek için kapağı bir ila iki dakika boyunca -20 °C dondurucuya yerleştirin; solucanlar felç olduktan sonra, toplam sayıyı tahmin etmek için bir stereo mikroskop yardımıyla beş µL başına düşen ortalama canlı yumurtadan çıkmış solucan sayısını sayın.

Daha önce hazırlanmış olan dondurulmuş OP 50 bakteri kültürünü birkaç dakika boyunca tezgah üzerinde bekleterek çözdürün. Ardından, her 500.000 çıkmış solucan başına üç mililitre %50 OP 50 ekleyin. Balonu 20 °C'de 100 RPM hızında çalkalayın.

Solucanlar yaklaşık 51 saat içinde L4 larva ve genç yetişkin evrelerine gelişecektir. İnkübasyon boyunca bakteri miktarını görsel muayene ile izleyin. Ortam berraklaşırsa daha fazla bakteri ekleyin.

Süspansiyon halindeki solucan kültüründen yaklaşık 0.5 millilitersini standart bir NGM agar plakasına aktarmak için steril bir serolojik pipet kullanın. Solucanların çoğunun L4 larvaları ve genç yetişkinler olduğundan emin olmak için onları bir stereo mikroskop altında inceleyin; parlak alan mikroskobisi altında, L4 larvalarının vücutlarının ortasında ventral bir şeffaf nokta bulunur. Genç yetişkinler ise biraz daha büyük olacaktır ve şeffaf noktaları bulunmayacaktır.

Ardından, solucan kültürünü steril 50 milliliter tüplere çekin. Tüpleri çeker ocak içindeki bir tüp rafına yerleştirin ve çatlamamış yumurtaların veya gelişmeyen solucanların çökmesine izin verin. Bunlar, gelişmiş solucanlara göre daha yavaş çöker.

10 dakika sonra, çatlamamış ve gelişmemiş solucanları içeren süpernatantı aspire ederek uzaklaştırın; her pelete yaklaşık 10 milliliters NGM tamponu ekleyin ve tüpleri hafifçe çalkalayarak solucanları süspande edin. Tüm solucanları tek bir 50 milliliters tüpte toplayın. Sallanan kovalı santrifüjde 500 RCF'de 30 saniye boyunca santrifüjleyin.

Ardından, solucanları yıkamak için 50 mililitre %1lb'li NGM içinde yeniden süspande edin. Bakterileri uzaklaştırmak için bu işlemi üç ila dört kez tekrarlayın. Tüpü, NGM artı LB tamponu ile 50 mililitreye tamamlayın.

Bunu, içinde manyetik karıştırıcı çubuk bulunan özel bir solucan dağıtım balonuna boşaltın ve bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Dağıtım balonu ve dağıtıcı kasetindeki boş alanı doldurmak için minimum yaklaşık 20 milliliters veya 60,000 solucan gereklidir. Daha önce gösterildiği gibi, üç adet beş microliter damladaki solucan sayısını sayın.

NGM artı LB içerisinde, beş mikrolitrelik damla başına 12 ila 15 solucan konsantrasyonuna ulaşacak şekilde sayım yapıldıktan sonra, her bir 3 84 kuyucuklu plaka için yaklaşık 35.000 solucan veya 11,5 mililitre süspansiyon halindeki solucan gereklidir. Dispansere 10 mikrolitrelik bir dağıtım kaseti yerleştirin ve %70 etanol ile hazırlama (priming) yaparak sterilize edin. Steril su ile hazırlama yaparak etanolü durulayın.

Dağıtıcı kasetin ucunu, manyetik karıştırıcının hareketini bozmayacak şekilde, hemen üzerine gelecek şekilde erlene yerleştirin. Solucanların erlen boyunca süspansiyon halinde kaldığından emin olun. Dağıtıcıyı, düşük hızda ve iki ön darbe (prime ve run) ile solucanları dağıtacak şekilde programlayın. En az 10 milliliters süspansiyon halindeki solucanı dağıtın.

Solucanların tüplerde çökelmesini önlemek için, test bileşiklerini halihazırda içeren mikrotitrasyon plakalarını hızla doldurun. Bu aşamada, önceden mikrotitrasyon plakasına yüklenmiş olan test bileşiği kullanılır. Parlama. Kuyucuklarda toz birikmesini önlemek için plakaları nefes alabilen bantla mühürleyin.

Plakaları, analiz için uygun sıcaklıktaki bir inkübatör içerisinde yer alan çalkalama platformuna yerleştirin. Hava akışını kısıtlayabileceği için plakaları üst üste istiflemeyin. Her bir kuyucuğun floresan yoğunluğunu uygun emisyon ve eksitasyon dalga boylarında ölçmek için hedef plağı bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin.

GFP için kullanılan filtreler 485 nm eksitasyon ve 528 nm emisyondur. RFP için kullanılan filtreler ise 540 nm eksitasyon ve 590 nm emisyondur. Plaka okunduktan sonra, GFP'nin RFP'ye oranını hesaplayın ve bireysel işlemlerden kaynaklanan floresan yoğunluğundaki kesin kat farkını belirlemek için bu oranı, aktive edici bileşik içermeyen kontrol kuyucuklarının okumalarıyla normalize edin.

Burada gösterilen SSKN deneyi, solucanların stereo mikroskop ile manuel olarak sayıldığı bir suş olan, kromozomal olarak entegre çift raporlama sistemini kullanır. Solucan sayısı, 0,94 R kare değeri ve 0,0001'den küçük p değeri ile dağıtılan hacimle korelasyon göstermiştir. Bu durum, her kuyucuğa dağıtılan solucan sayısının, dağıtılan hacim ayarlanarak kontrol edilebileceğini göstermektedir.

Bu şekillerde, solda gösterilen kuyu başına toplam GFP floresansı ve sağda gösterilen kuyu başına RFP floresansı, 384 kuyulu bir plaka genelinde kuyudan kuyuya oldukça tekrarlanabilirdir. XS, her kuyuda ölçülen bağıl floresansı belirtir. Düz çizgiler ortalamaları, kesikli çizgiler ise tüm kuyuların ortalama floresansının üç standart sapma üstünü veya altını göstermektedir; varyasyon katsayısı %9'un altındadır. Bu şekilde gösterildiği üzere, GST 4 promotöründen gelen GFP floresansı, 384 kuyu genelinde DOP 3 promotöründen gelen RFP floresansı ile 0,62 R kare değeri ve 0,0001'den küçük p değeri ile doğrusal olarak koreledir.

Bu nedenle, indüklenebilir olmayan RFP raporlayıcısı, indüklenebilir GFP raporlayıcısını normalize etmek için kullanılabilir. GFP'nin RFP floresanına oranı ifade edildiğinde, 384 kuyucuklu bir plaka boyunca kuyucuktan kuyucuğa yüksek düzeyde tekrarlanabilir hale gelir.

GFP'nin RFP'ye oranının hesaplanması, varyasyon katsayısını %6'nın altına indirmiş ve burada gösterildiği üzere, DOP üç promoter RFP raporunun değişkenliği azaltma yeteneğini kanıtlamıştır. SK N bir aktive edici ksenobiyotik ile RFP'ye göre GFP indüksiyonu, 384 kuyucuklu bir plaka genelinde güçlü ve yüksek derecede tekrarlanabilirdir; tüm kontrol ve due GLO kuyucuklarının ortalama bağıl floresan oranları düz çizgilerle işaretlenmiştir. Kontrol ortalamasının üç standart sapma üzeri ve dlo ortalamasının üç standart sapma altı kesikli çizgilerle işaretlenmiştir.

Tek bir kez öğrenildiğinde, bir solucan kültürü başlatma işlemi birinci günde yaklaşık bir saat sürer; toplama ve dağıtma işlemleri ise uygun şekilde yapıldığında yaklaşık iki saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, başlangıçta en az 60.000 solucan ile başlanması ve dağıtma sırasında solucanların süspansiyon halinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu prosedür takip edilerek yapılan taramaların ardından, örneğin diğer indüklenebilir yollar için rapor dizileri, diğer yollar için modülatörler geliştirmek amacıyla uygulanabilir.

Bu teknik, yüksek kapasiteli tarama ve biyosensörleme alanlarındaki araştırmacıların, küçük moleküllü yol modülatörlerini hızla tanımlamalarına veya çevresel kirleticileri tespit etmelerine olanak sağlayabilir. Bu videoyu izledikten sonra, indüklenebilir transkripsiyonel yollar için yüksek kapasiteli tarama yaparken veya çevresel kirleticiler için birden fazla örneği test ederken, floresan elegan suşlarının nasıl kültüre edileceği, dağıtılacağı ve ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.