Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

AIDS'e yol açan virüs olan HIV ile 60 milyondan fazla birey enfekte olmuştur. HIV/AIDS küresel bir sağlık krizidir ve yoğun araştırma çalışmaları enfekte bireylerin yaşam sürelerini önemli ölçüde uzatmış olsa da, gerçek bir aşı hala bulunamamıştır. HIV aşı araştırmalarının ana odak noktası, HIV'in hedef hücrelere girmek için kullandığı zarf glikoproteiniyle ilgilidir.

Bu videoda, kriyojenik elektron tomografisi adı verilen bir görüntüleme tekniğini kullanarak bu önemli proteinin yapılarını nasıl elde ettiğimizi gösteriyoruz. Saflaştırılmış HIV ile başlayarak, dondurulmuş örneklerin hazırlanma aşamalarını, bu dondurulmuş örneklerden elektron mikroskobik görüntülerin kaydedilme aşamalarını ve bu görüntülerin HIV/AIDS aşı tasarımı için yararlı olabilecek yapısal modellere dönüştürülme aşamalarını sunuyoruz. Bu videoda sunduğumuz çalışmanın benzersiz bir yönü, çalışmanın ortaokul ve lise öğrencilerinden üniversite ve lisansüstü öğrencilerine, oradan doktora sonrası araştırmacılara ve kıdemli bilim insanlarına kadar geniş bir yaş yelpazesine yayılan laboratuvar üyeleri tarafından gösterilecek olmasıdır.

Kriyo-elektron tomografisi için uygun vitrifiye virüs örneklerinin hazırlanması, virüslerin sulu bir süspansiyonunun bakır ızgara destekli bir karbon film üzerindeki küçük deliklere yayılması ve ardından virüslerin hızla dondurulmasıyla gerçekleştirilir. Bu adımın amacı, doğal durumuna yakın bir halde yakalanmış, bozulmamış virüslerden oluşan dondurulmuş bir numune hazırlamaktır. Başlamak için ızgaralar bir glow discharge ünitesinin içine yerleştirilir.

Bu cihaz, ızgaraları iyonize gaza maruz bırakarak temizler. Izgaralar kullanıma hazır hale geldiğinde, küçük altın parçacıkları ile karıştırılmış bir virüs süspansiyonu hazırlanır. Bu parçacıklar, veri toplama ve işleme için gereklidir.

Ardından, taze plazma ile temizlenmiş ızgara üzerine bir damla virüs süspansiyonu yerleştirilir. Izgara daha sonra, bir filtre kağıdı ile silerek damlayı ince bir sıvı filme dönüştüren bir robota yüklenir. Örnek daha sonra, virüsleri saniyede 100, 000 kelvin'i aşan bir hızla hızla donduran sıvı etana daldırılır.

Ardından, dondurulmuş ızgara mikroskoba taşınmak üzere bir saklama kutusuna aktarılır. Bu işlem, istenen sayıda ızgara dondurulana kadar tekrarlanır. Virüs örnek ızgaraları hazır olduğuna göre, bir sonraki adım onları mikroskoba yerleştirmektir.

Görüntüleme işlemi manuel olarak veya robotik destekle gerçekleştirilebilir. Örnek ızgaraları manuel olarak yüklendiğinde, kullanıcı örneklerin sıvı azot altında manipüle edilebildiği özel bir istasyonda oturur; örnekler, sızdırmaz hale getirilen, vakumlanan ve ardından mikroskoba bağlanan taşınabilir azot soğutmalı bir hazneye yerleştirilir. Yeni nesil mikroskoplar, daha otomatik örnek yükleme kapasitesine sahiptir.

Buradaki bir Titan Cryos mikroskobunda, dondurulmuş örnekler kullanıcı tarafından mikroskoba getirilir ve ardından örnek ızgaraları mikroskoba robotik olarak yüklenir. Görüntüleme başlamadan önce her bir ızgara kullanıcı tarafından incelenebilir. Mikroskop parametreleri, örnek ızgarası üzerinde ilgi çekici özelliklerin bulunduğu her alan için ayarlanır.

Bu vakada, özellikler HIV virüsleridir. Her yeni alan tanımlandığında, mikroskop bilgisayarı alana özgü görüntüleme parametrelerini kaydeder. Kullanıcı ilgilenilen tüm konumları tanımladığında, bilgisayar her konumu otomatik olarak yeniden ziyaret eder ve bir veri seti toplar.

Her bir veri seti, elektron demetinin ızgaranın aynı noktasında odaklanmış olduğundan emin olunurken, örnek ızgarasının elektron demetine göre eğilmesiyle toplanır. Elektron mikroskobunda veri toplama işlemi, geleneksel olarak kullanıcıların mikroskobun başında oturmasını ve ekipmanla fiziksel olarak etkileşime girmesini gerektirmiştir. Bu mikroskop etkileşim tarzı, burada Başkan Obama'nın bir Intel fabrikasını ziyareti sırasında gösterilmektedir.

Mikroskop bilgisayar arayüzlerindeki son gelişmeler, kullanıcıların veri toplamayı laboratuvardaki veya başka bir yerdeki uzak bir bilgisayardan gerçek zamanlı olarak izlemesine ve ayarlamasına olanak tanımaktadır. Zar yapısını ve glikoprotein spike'larını görselleştirmek için, sinyali artırmak amacıyla yüzlerce bireysel görüntüden gelen bilgilerin ortalaması alınmalıdır. Bu, Bio Wolf adı verilen bir bilgisayar kümesi kullanılarak gerçekleştirilen, hesaplama açısından yoğun bir işlemdir.

NIH bünyesinde, bireysel hacimleri çıkarmak ve yüksek gürültü seviyelerinde çalışabilen algoritmalar kullanarak bilgileri ortalamak için güçlü yöntemler geliştirilmiştir. Bu veri türünün doğası gereği, hem doğal virüslerden hem de biyolojik olarak önemli moleküllerle kompleksleştirilmiş virüslerden elde edilen yoğunluk haritaları, HIV'nin yapısal biyolojisi üzerine zengin bir bilgi veri tabanı sunmaktadır. Veriler, zar glikoprotein spike'ını oluşturan bireysel alt birimlerin x-ışını kristalografisi ile elde edilen bilgilerle birleştirildiğinde, yoğunluk haritaları moleküler detayda anlam kazanmaktadır.

Bu tomografilerden elde edilen veriler çok yoğun olabilir ve yorumlanması zorlayıcı olabilir. Eğlence endüstrisi için geliştirilen 3D yazılımlar; renkler, dokular ve ışıklandırmalar ekleyerek 3D modelleri görselleştirmek için kullanılabilir ve böylece modellerin analizini kolaylaştırır. Yaygın olarak kullanılan görselleştirme yazılımları arasında Mirror 3D Studio Max ve Maya yer alır.

Saflaştırılmış HIV'den başlayarak, zar glikoproteininin yapısına ait moleküler modellerin nasıl elde edilebileceğine dair adım adım prosedürleri göstermiş olduk. Bu yöntemi kullanarak, zar glikoproteininin virüse bağlanabilen ve virüsü kullanabilen çeşitli moleküllerle oluşturduğu komplekslerin yapılarını da belirledik.

Burada, zar glikoproteininin B12 adlı bir antikorla kompleks halindeki yapısına dair bir örnek sunuyoruz. Bazı moleküllerin neden virüse bağlanabildiğini ve onu kullanabildiğini, bazılarının ise neden bunu yapamadığını anlamak, rasyonel aşı tasarımı için oldukça önemlidir. HIV veya influenza ve Ebola gibi diğer virüslerin zar glikoproteinlerinin moleküler yapılarını belirlemek, viral girişi ve kullanımı anlamanın anahtarıdır.

Gördüğünüz üzere, kriyoelektron tomografisi artık bu hedefe ulaşmak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmaktadır.