İzleme Araştırmaları Qdot nanokristaller murin Kemik İliği-türevli dendritik hücrelerin üretilmesi ve Etiketleme

Bu prosedürün genel amacı, Q nokta nanokristallerini kullanarak görüntüleme çalışmaları için dendritik hücreler hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle kemik iliği hücrelerinin murn, femur ve tibialardan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, GM CSF varlığında hücrelerin dendritik hücrelere farklılaşmasını kolaylaştırmak için kemik iliği hücre kültürleri kurulur.

Ardından, sekiz gün sonra dendritik hücreler kemik iliği hücre kültürlerinden geri kazanılır. Prosedürün son adımı, hücrelerin floresan Q nano kristallerle boyanmasıdır. Sonuç olarak, parlak şekilde boyanmış dendritik hücreler floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir.

Bu teknolojiyi GFP etiketli dendritik hücreler kullanmak gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında kullanmanın temel avantajı, Q-nokta nanokristallerinin aseton gibi organik çözücülerle boyama işleminden sonra bile floresan özelliklerini korumalarıdır. Bu yöntem, dendritik hücre biyologlarının, bu hücrelerin farklı hastalıklardaki veya farklı hastalıklar bağlamındaki göç özellikleri gibi temel soruları yanıtlamalarına yardımcı olabilir. Boyama prosedürünü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Maria Ali uygulamalı olarak gösterecektir.

Sakrifyasyon sonrası, kemik uçlarını kesmemeye dikkat ederek iki fareden tibia ve femur kemiklerini dikkatlice diseke edin. Ardından, kemikleri kırmamaya özen göstererek, yapışmış olan tüm dokuları kağıt havlu ile temizleyin. Bu işlem biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

35 mm'lik bir Petri kabını %70 etanol ile doldurun ve ardından kemikleri 10 dakika boyunca etanolda bekletin. Kemikler sterilize edildikten sonra onları etanolden çıkarın ve yeni bir Petri kabında beş dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Şimdi, femur kemiğini ortadan, tibia kemiğini ise en ince uçlarından kesin.

Steril bir şırınga kullanarak kemiklerin iç kısmına bir mililitre RPMI medyumu enjekte edin. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve salıncaklı kova rotorlu bir santrifüjde, dört santigrat derecede 300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek RPMI medyum ile iki kez yıkayın. Son yıkamanın ardından, eritrositleri uzaklaştırmak için hücreleri iki mililitre CK lizis tamponu içinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, 13 mililitre %10 FBS içeren RPMI ekleyin ve hücreleri bu ortamda, daha öncekiyle aynı santrifüj ayarlarını kullanarak iki kez daha yıkayın. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu mililitre başına iki x 10⁵ hücre olacak şekilde ayarlayın. %10 FBS içeren RPMI ile birlikte, final konsantrasyonu 20 nanogram/mililitre olacak şekilde rekombinant murin G-M-C-S-F ekleyin.

Ardından, bu süspansiyondan 10 mililitreyi steril mikrobiyolojik kaliteye sahip 10 santimetrelik bir Petri kabına ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir karbondioksit inkübatöründe kültüre edin. Üç gün sonra, hazırlanan her bir plağa 20 nanogram/mililitre rekombinant murine G-M-C-S-F içeren %10 FBS'li RPMI'dan 10 mililitre daha ekleyin.

Üç gün sonra, her bir Petri kabından 10 mililitre hücre süspansiyonu alın, hücreleri aynı koşullar altında santrifüjleyin ve pelletlemiş hücreleri, Petri kaplarından alınanla aynı hacimde %10 FBS içeren RPMI içinde yeniden süspande ederek yeni rekombinant murin G-M-C-S-F ile takviye edin. Son olarak, hücre süspansiyonunu orijinal Petri kaplarına geri aktarın ve hücreleri karbondioksit inkübatöründe iki gün daha kültüre edin. Sekiz günlük kültür süresinin ardından, Petri kaplarını taze besiyer ile yıkayarak yüzen ve gevşek yapışık hücreleri toplayın.

Ardından, üretici talimatlarına sıkı sıkıya uyarak, 5 × 10⁶ fare kemik iliği kaynaklı DC'yi 10 nM konsantrasyondaki Q nano kristalleri ile işaretlemek için Q tracker 6 55 hücre işaretleme kiti ile işaretleyin. Öncelikle, kit bileşenleri A ve B'den beşer µL'yi bir eppendorf tüpünde karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra, 1 mL %10 FBS içeren RPMI ekleyin ve tüpü 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Ardından, 0,5 mililitre RPMI artı %10 FBS içinde süspande edilmiş beş x 10⁵ Dcs ekleyin ve hücreleri D çözeltisi içinde 37 °C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. Sonra hücreleri, öncekilerle aynı koşullar altında RPMI artı %10 FBS ile iki kez yıkayın ve peleti RPMI içinde yeniden süspande edin.

Bu şekil, dcs'nin floresan mikrograf örneğini göstermektedir. Etiketleme işleminin hemen ardından, etiketlenmiş hücrelerden bir damla cam lam üzerine damlatılmış ve bir lamel ile kapatılmıştır. Ardından örnekler, floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir.

Bu şekilde, 48 saatlik in vitro olgunlaşma sonrası dcs'lerin işaretlenmiş floresan mikrofotografı görülmektedir. Dcs'ler, bir karbondioksit inkübatöründeki lam kültürü odacıklarında 100 ng/mL LPS ve 20 ng/mL TNF alpha ile 48 saat boyunca kültüre edilmiştir. Ardından örnekler PBS ile yıkanmış, aseton ile fikse edilmiş, DPI ile karşıt boyama yapılmış ve floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir.

İn vitro ortamda olgunlaştırılan etiketli dcs'ler akış sitometrisi ile analiz edildi; Q dot ile boyanmış hücreler FL üç kanalında güçlü bir sinyal verdi (Q dot boyalı ve boyanmamış). Dcs'ler ayrıca olgunlaşma belirteçleri olan CD 86 ve CD 40'a karşı spesifik antikorlar ve izotip kontrolleri ile boyandı, ardından akış sitometrisi ile analiz edildi. Ek olarak, olgun Q boyalı DCS'lerin ve kontrollerin süpernatantlarında IL altı ve nitrik oksit seviyeleri belirlendi.

Burada, diseke edilmiş bir dokudaki işaretlenmiş DCS'nin temsili bir figürü gösterilmiştir. Olgun DCS'ler C 57 black six farelere intravenöz olarak enjekte edilmiştir. Üç gün sonra fareler sakrifiye edilmiş ve dalaklar toplanmıştır.

Örnekler OCT içinde şok dondurularak gömülmüş ve kriyostat kullanılarak sekiz mikron kalınlığında kesitler hazırlanmıştır. Ardından örnekler aseton ile fikse edilmiş, DPI ile karşıt boyama yapılmış ve floresan mikroskop kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu prosedürler takip edilmiştir.

Farklı olgunlaşma stimülasyonlarına yanıt olarak dendritik hücrelerin göçü gibi ek soruları yanıtlamak için, antijen sunumu veya farklı stimülasyonlarla olgunlaştırma gibi diğer yöntemler uygulanabilir.