İzolasyon, Arıtma ve İşlevsel Araştırmalar ve Kabul edilmiş Transfer deneyler için Fare Kemik İliği Nötrofiller Etiketlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, aşağı akış fonksiyonel çalışmaları ve evlat edinen transfer deneyleri için fare kemik iliğinden nötrofilleri izole etmek ve etiketlemektir. Bu, önce murin, femur ve tibiadan kemik iliği hücrelerinin toplanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşamada, kırmızı kan hücreleri sırasıyla% 0.2 ve% 1.6 sodyum klorür çözeltileri içinde sırayla süspanse edilerek ozmotik olarak bağlanır.

Daha sonra, nötrofiller yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile izole edilir. Son adımda, nötrofiller hücre izleyici boyalarla etiketlenir. Sonuç olarak, akış sitometrisi, çeşitli fare dokularına alınan evlat edinici olarak aktarılan nötrofillerin sayısını belirlemek için kullanılabilir.

Fare nötrofillerinin kemik iliğinden kan veya periton üzerinden izole edilmesinin temel avantajı, aşağı akış fonksiyonel çalışmaları ve evlat edinici transfer deneyleri için yeterli sayıda hücrenin hem kararlı durumda hem de enfeksiyondan sonra kemik iliğinden elde edilebilmesidir. Fare nötrofillerini izole etmek için floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasının immünomanyetik seçimine göre bir gradyan santrifüjleme tekniği kullanmanın avantajı, hızlı, ekonomik olması ve nötrofilleri nötrofil aktivasyonunu indükleyebilecek antikorlarla etiketlemekten kaçınmasıdır. Prosedürü göstermek, ötenazi yapılmış bir fareye% 70 etanol püskürttükten sonra laboratuvarımdan bir teknisyen olan muca swami us olacak.

Hayvanın derisinin orta karın bölgesinde bir kesi yapın ve ardından deri dokusunu alt ekstremiteler de dahil olmak üzere hayvanın distal kısmından çıkarın. Daha sonra, hayvanın arka bacaklarından kasları kesmek için makas kullanın ve ardından uyluk kemiğinin başını kırmaktan kaçınarak ACE beum'u kalça ekleminden dikkatlice çıkarın. Ardından, femur ve kaval kemiğinden kalan kasları çıkarmak için makası bir neşterde kullanın.

Diz eklemindeki bacak kemiklerini, kemik uçlarını kırmamaya dikkat ederek ayırın ve ardından kemikleri buz gibi soğuk RPMI 1 6 4 oh içeren bir Petri kabına yerleştirin. FBS ve antibiyotiklerle takviye edin. Çanağı bir doku kültürü başlığına aktarın ve ardından her bir kemiğin dışını yeni bir Petri kabında %70 etanol ile sterilize edin.

Yaklaşık 10 ila 15 saniye sonra, etanolü her bir kemiğin yüzeyinden durulayın ve ardından buz gibi, steril PBS'de üç yıkama yapın. Daha sonra epifizi kemiklerin her birinden kesin ve yeni bir steril Petri kabına yerleştirin. Ardından, 10 mililitre RPMI ile doldurulmuş 12 cc'lik bir şırıngaya 25 gauge bir iğne takın.

FBS ve EDTA ile takviye edin. Daha sonra, her bir femur tibia çiftinin şaftının her iki ucundaki kemik iliği hücrelerini, tüm hücreleri çıkarmak için 100 mikrometrelik bir filtre ile solmuş 50 mililitrelik vidalı bir Falcon tüpüne yıkayın. İğne ucu ile kemiklerin iç yüzeylerini kazıyın.

Kemikler beyazlamış gibi göründüğünde, hücreler yeterince çıkarılmıştır. Şimdi kemik epifizlerini 0,5 ila bir milimetrelik küçük Q parçalarına kesmek için bir neşter kullanın ve ardından 2,5 mililitrelik einor tarak ucunun arka ucunu ve BioPure pipet ucunu kullanarak bunları 100 mikrometre filtreden geçirin. Hasat edilen hücreleri 427 kez G ve dört santigrat derecede yedi dakika döndürdükten sonra, kırmızı kan hücreleri yaklaşık 20 saniye boyunca 20 mililitre% 0.2 sodyum klorür içinde toplanır.

Daha sonra 20 mililitre% 1.6 sodyum klorür ile lizisi durdurun, hücreleri döndürün ve ardından peleti FBS ve EDTA ile RPMI 1 6 4 oh takviyesinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve tekrar döndürdükten sonra, yıkanmış peleti bir mililitre buz başına en fazla 10 kez 10 ila altı hücrede yeniden süspanse edin. Soğuk steril PBS Şimdi üç mililitre 18 ila 26 santigrat derece, opak 1 1 1 9'u 15 mililitrelik bir konik tüpe dağıtın ve ardından yavaşça 18 ila 26 santigrat derece üç mililitre kaplayın.

Onun opak 1 0 7 7. Opak olanı hazırladıktan hemen sonra iki yoğunluğu karıştırmaktan kaçınarak, kemik iliği hücresi süspansiyonunu opak 1 0 7 7 santrifüjünün üzerine dikkatlice katman, yoğunluk gradyanı 30 dakika boyunca 834 kez G ve 25 santigrat derece Santigrat derece aralıksız ve ardından nötrofilleri opak 1 1 1 9 ve 1 0 7 7 katmanlarının arayüzünde toplayın. Toplanan nötrofilleri RPMI 1, 6, 4, oh, FBS ve antibiyotiklerde iki kez yıkadıktan sonra, Resus, hücreleri PBS'de mililitre başına 10 ila altı hücreye beş kez askıya alır, 37 santigrat dereceye kadar ısıtın.

Hücreleri saydıktan sonra, akış sitometrisi ile saflığı ve canlılığı belirlemek için her deney örneğinden küçük bir alikot ayırın ve ardından kalan nötrofilleri, karanlıkta çalkalama su banyosunda 37 santigrat derecede 10 dakika boyunca beş mikromolar final konsantrasyonunda bir hücre izleyici boya ile etiketleyin. Son olarak, alt akış rekabetçi yeniden popülasyon çalışmaları için diferansiyel olarak etiketlenmiş nötrofil popülasyonlarını karıştırmadan önce boya çapraz kontaminasyonunu önlemek için hücreleri buz gibi soğuk RPMI 1 6 4 oh FBS ve antibiyotik takviyesi ile iki kez yıkayın, burada, enfekte olmamış bir C 57 siyah altı fareden kemik iliği izole yoğunluk gradyanı ayrılmış nötrofillerin temsili akış sitometrisi grafikleri bu panelde gösterilmektedir. Histopath 1 1 1 1 9 ve histopath 1 0 7 7'nin arayüzünden toplanan kemik iliği hücreleri için kullanılan ilk geçit.

İleri ve yan saçılma kullanılarak, yoğunluk gradyanıyla ayrılmış nötrofillerin% 90'dan fazla saf ve% 95'ten daha büyük olduğu, evlat edinen transfer hücresi izleyicisinden sonra en az dört saat boyunca uygulanabilir olduğu gösterilmiştir. DIA etiketli nötrofiller, çeşitli fare sorunlarında akış sitometrisi ile izlenebilir. Örneğin, bu deneyde gösterilen alıcı kandida ile enfekte C 57 siyah altı farenin kanında, kemik iliğinde ve böbreklerinde, canlı CD 45 LY altı G CD 11 B hücresi üzerinde geçit oluşturularak, bu temsili olarak evlat edinilmiş olarak transfer edilen C-M-T-M-R etiketli nötrofiller, PE ekspresyonları ile alıcı farenin doğal C-M-T-M-R ve PE negatif nötrofillerinden ayırt edilebilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, fare kemik iliği nötrofillerinin izolasyonu ve etiketlenmesi üç saat içinde tamamlanabilir.