Aktivitesi miktarının Cis Düzenleme Elemanları

Bu prosedürün genel amacı, fare retinal implantlarını floresan transkripsiyonel raporlayıcılar ile elektropore etmek ve bunların ekspresyon seviyelerini nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle diseksiyon yoluyla neonatal fare retinal dokusunun izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, retinayı floresan DNA raporlayıcı konstrüktlar ile elektropore etmektir.

Prosedürün üçüncü adımı, elektropore edilen retinaların sekiz gün boyunca implantlar şeklinde kültüre edilmesidir. Prosedürün son adımı ise retinal eksplantların toplanması ve floresan raporlayıcıların ekspresyon seviyelerinin belirlenmesidir. Sonuç olarak, eksplant elektroporasyonu ve ardından yapılan kantitatif veri analizi yoluyla, gelişmekte olan fare retinasındaki farklı promotör raporlayıcı konstrüktların göreceli ekspresyon seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Benim adım Joe Corbo; St. Louis'teki Washington University School of Medicine Patoloji ve İmmünoloji Bölümü'nde öğretim üyesiyim. Bugün, fotoreseptöre özgü CYS düzenleyici elementlerin aktivitesini nicelleştirmek amacıyla, yeni doğmuş fare retinalarına ex vivo elektroporasyon tekniğini gösteren bir video protokolü sunacağız; bu protokolü laboratuvarımdan lisansüstü öğrencisi Cindy Montana uygulamalı olarak gösterecek. İlk olarak, göz toplama işlemine hazırlık amacıyla, elektroporasyon haznesini ve tüm aletleri %70 etanol ile sterilize edin.

Her iki eldiveni ve tezgahı etanolle dezenfekte edin ve prosedür boyunca steril koşulları koruyun. Ardından, bir doku kültürü kabininde, bir adet steril 60 mm'lik Petri kabına altı mililitre diseksiyon besiyeri ve iki adet steril 35 mm'lik kaba üçer mililitre besiyeri pipetleyin. Tekrar tezgaha dönerek, yeni doğmuş bir fare yavrusunun baş ve boyun bölgesini %70 etanol ile dezenfekte edin.

Makas kullanarak baş hızlıca koparıldıktan sonra, baş steril bir 100 milimetrelik kaba aktarılır ve bir diseksiyon mikroskobu altında gözleri açığa çıkarmak için kafa derisi küçük makaslarla kesilir. Kavisli pensler kullanılarak göz nazikçe orbitiden çıkarılır ve ardından diseksiyon ortamı içeren 35 milimetrelik bir kaba yerleştirilir. Elektroporasyon yapılacak her bir DNA alikotu başına üç ila dört göz olacak şekilde göz toplama işlemine devam edilir; işlem tamamlanana kadar gözler ve diseksiyon ortamı oda sıcaklığında tutulur.

Hem bir jiletle hem de steril bir plastik transfer pipetinin ambalajını %70 etil alkol ile dezenfekte edin ve ardından jileti kullanarak, tüm bir gözün pipetlenebileceği kadar yüksekten pipetin ucunu kesin. Genişletilmiş pipeti kullanarak, yüksek büyütmeli bir diseksiyon mikroskobu altında 35 milimetrelik kaptan 60 milimetrelik kaba bir göz aktarın. Göz yüzeyindeki ekstraoküler kaslar ve yağ gibi tüm dokuları temizlemek için ince pens kullanın.

Ardından, optik siniri tabanından sıkarak çıkarın. Retinayı izole etmek için, limbus bölgesindeki sklerada küçük bir delik açın; skler ve retinal pigment epiteli, mat gri renkteki retinal dokuya kıyasla parlak görünür. Her iki penset takımından birer ucu deliğe yerleştirin ve skler ile RPE'yi nazikçe yırtarak açın.

Lensin yerinde kaldığından emin olun. Diseke edilen retinayı, içerisinde besiyeri bulunan ikinci 35 milimetrelik kaba aktarmak için genişletilmiş pipeti kullanın. Tüm retinaları toplayın ve 37 derece Celsius sıcaklıktaki doku kültürü inkübatöründe saklayın.

Elektroporasyon işlemi için, elektropore edilecek her bir DNA alikotu için doku kültürü kabininde çalışarak, bir adet steril 35 milimetrelik tabağı disseksiyon ortamı ile ve ikinci bir tabağı kültür ortamı ile doldurun. P 200 pipet kullanarak, elektroporasyon tabağındaki odacıkları steril 1X PBS ile 3 kez yıkayın. Odacıkları 60 µL DNA alikotları ile doldurun ve kullanılmayan tüm odacıkları 60 µL 1X PBS ile doldurun.

Elektrotları elektroporasyon kabına bağlayın ve elektro cihazına uygun ayarları girin. Retinaları lens kısmından tutmak için ince pens kullanın ve onları elektroporasyon odacıklarına aktarın. Her odacığa dört adete kadar retina yerleştirin.

Retinaları, lensin pozitif elektroda bağlı metal çubuğa yaslanacağı şekilde düzenleyin. Bir odadan diğerine DNA taşınmasını önlemek için her oda arasında pensetleri silin. Tüm retinalar hizalandıktan sonra, elektroforez cihazında başlat düğmesine basın.

Negatif elektroda bağlı metal çubuk üzerinde küçük kabarcıklar oluşmalıdır. Elektrotların bağlantısını kesin ve pens yardımıyla elektrofor cihazını kapatın. Retinaları nazikçe hazne duvarlarından uzaklaştırın.

Retinaları kameralardan, diseksiyon medyumu içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Steril bir transfer pipeti kullanarak retinaları diseksiyon medyumu içinden kültür medyumu içeren 35 milimetrelik kaplara aktarın. Steril altı kuyucuklu bir kültür plağının kuyucuklarını etiketleyin ve her bir kuyucuğu üç mililitre kültür medyumu ile doldurun.

Steril pensler kullanarak, her bir kuyucuktaki besiyerinin üzerine yuvarlak watman nucleo filtreleri, filtrelerin parlak yüzeyleri yukarı bakacak şekilde yüzdürün. Bir disseksiyon mikroskobu yardımıyla, tek bir retinayı steril transfer pipeti ile lens tarafı aşağı gelecek şekilde filtrenin üzerine aktarın. Eğer retina lens tarafı yukarı bakacak şekilde yerleşirse, retinayı tekrar pipete çekin ve işlemi tekrarlayın.

Her kuyucuğa en fazla dört retina yerleştirin ve bunları ayrı damlacıklar halinde tutun. Retinalar kuyucuklara yerleştirildikten sonra, kültür plağını 37 °C'lik bir doku kültürü inkübatörüne taşıyın ve istenen süre boyunca büyütmeye bırakın. Genellikle burada görülen sekiz günlük süreç, DNA konstrüktünün retinal yüzeyin dörtte birinden üçte birine yayılmasıyla sonuçlanan başarılı bir elektroporasyon sağlar.

Floresans seviyeleri, CRE konstrüktunu eksprese eden tekdüze elektropore edilmiş bölgelerin retina dışındaki bölgelerle karşılaştırılması ve ardından kontrol GFP ekspresyonuna göre normalize edilmesiyle nicelleştirilir. Özellikle rod fotoreseptörlerin verimli bir şekilde transduse edildiği gösterilmiştir. Burada, dış nükleer tabakada iki rod spesifik promotörün GFP ve DS red ekspresyonunu yönlendirdiği bir elektroporasyonun sonuçları yer almaktadır.

Burada mavi renkte gösterilen DPI boyaması ile iki ekspresyon örüntüsü üst üste bindirildiğinde, fotoreseptöre özgü ekspresyon belirgin hale gelmektedir. Ne interpleksiform tabakada ne de ganglion hücresi tabakasında herhangi bir ekspresyon gözlemlenmemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, retinal sist düzenleyici elementlerin aktivitesini nicelendirmek amacıyla fare retinal eksplantlarının nasıl diseke edileceği ve kültüre edileceği konusunda iyi bir fikir edinmiş olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.