Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi

Jane, Ling Wang, Han Jang ve John Burgandy, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi, Oregon İşitme Araştırma Merkezi tarafından hazırlanan in Vivo Elektroporasyon ile Gelişen Fare İç Kulağına aktarımı gerçekleştirdi. Merhaba. Benim adım John Burgandy. Laboratuvarım, Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi bünyesindeki Oregon İşitme Araştırma Merkezi'nde bulunmaktadır.

Benim adım Ang. Johns laboratuvarında poster sunan biriyim. Ayrıca Johns laboratuvarında araştırma asistanı olarak görev yapıyorum.

Sunumumuz dört bölüme ayrılmıştır. Birincisi ventral laparotomidir. Sodyum pentobarbital bazlı anesteziyi, anestezinin yeterliliğinin nasıl test edileceğini, kornea korumasını, cerrahi alanın hazırlanmasını, dezenfeksiyonu, fare sağkalım cerrahisi veri sayfasını, cerrahi seti, deri ve karın duvarı boyunca ventral orta hat insizyonunu ve uterus kornularının eksternalizasyonunu gösteriyoruz.

İkinci bölüm trans-uterin mikroenjeksiyondur. Embriyonun trans-illuminasyonunu, embriyonun yeniden yönlendirilmesini, mikroenjeksiyonu, pipet hazırlanmasını ve embriyonik gün 11.5 ile embriyonik gün 12.5'te otikte mikroenjeksiyonu gösteriyoruz. Üçüncü bölüm in vivo elektroporasyondur.

Ped tipi elektrot yerleşimini ve embriyonik 11,5. gün fare O asistinin elektroporasyonunu gösteriyoruz. Dördüncü bölüm temsili sonuçları içermektedir. Geç embriyonik ve erken postnatal koklealarda GFP ekspresyonunu gösteriyoruz.

Bu işlem, embriyonik gün 11,5'te Otis'e ekspresyon plazmidinin in vivo elektroporasyonu ile gerçekleştirilmiştir; birinci bölüm: ventral laparotomi. Anne, boyun arkasındaki deri, kuyruk ve sol arka ekstremite tutularak güvenli bir şekilde sabitlenir. Abdomen %70 etanol ile silindikten sonra, sodyum pentobarbital bazlı anestezik ile intraperitonal enjeksiyon uygulanır.

Anestezinin etki etmesi için fare, dört ila beş dakika boyunca kendi kafesinde tutulur. Anestezinin yeterliliğini değerlendirmek için ayak ve kuyruk sıkıştırma testleri uygulanır. Bu anne fare kuyruk sıkıştırmasına yanıt olarak titrer ve zararlı uyaranlara karşı tepkisiz hale gelmeden önce iki dakika daha bekletilmesi gerekir.

Korneaların kurumasını önlemek için gözlere steril oftalmik pomad uygulanır. Kürk ve deri döküntülerinin yayılmasını en aza indirmek için cerrahi alanı kimyasal bir çeker ocak içerisinde hazırlarız. Karın duvarını örten cildi açığa çıkarmak için kürkler ince bir bıçakla tıraş edilir.

Kılların tamamen temizlenmesi, operasyon sonrası insizyonun iyileşmesini kolaylaştırır. Karın derisinin dezenfeksiyonu; %70 etanol, Betadine ve %70 etanol ile ardışık geçişler yapılarak gerçekleştirilir. Her zaman rostralden kaudale doğru silme işlemi yapın ve her seferinde yeni bir cerrahi pamuk veya pamuklu aplikatör kullanın.

Her geçişte, damın tepkisiz olduğundan emin olmak için dezenfeksiyon sırasında solunumların derinliğini ve kalitesini değerlendiririz. İkinci %70 etanol geçişinden sonra, damı hemen ventral yüzeyi aşağı gelecek şekilde steril bir örtü üzerine yerleştirdik ve ısınması için iki ila üç dakika boyunca ısıtmalı bir ped üzerine koyduk. Bu süre, fare sağkalım cerrahi kayıt formuna ameliyat öncesi verileri kaydetmek için uygun bir zamandır. Fare sağkalım cerrahi veri formumuzu ek bilgi olarak ekledik.

Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım komitenizin; ameliyat öncesi, ameliyat sırası ve ameliyat sonrası verileri nasıl izleyeceğinizi görebilmesi için veri sayfasını ve hayvan bakım protokolünüzü eklemeyi düşünün. Her cerrahi denek için bir kayıt sayfası dolduruyoruz. Kemirgenler için genellikle zorunlu olmasa da cerrahi işlemleri steril bir ortamda gerçekleştirmeyi tercih ediyoruz.

Çalışma yüzeyi, üfleyici motor ve plenum gövdesinden ayrıdır, böylece kullanıcıya herhangi bir titreşim iletilmez. Mikroenjeksiyon sırasında, in utero gen transferini kolaylaştırmak için laminar akışlı kabinimizde yaptığımız modifikasyonların bir şemasını ek bilgi olarak sunduk; temel değişiklikler düşük watt zorlaması ve raylı aydınlatma kesikleri ile cihaz güç kabloları için gizli prizler ve aksesuar elektrik devreleri için bir yönlendirme yoludur. Cerrahi set; elektrikli laktatlı ringer IV torbası, sıcak banyo, XY, Z manipülatörü, stereo floresan diseksiyon mikroskobu, fiber optik ışık kaynağı ve cerrahi aletlerden oluşmaktadır.

Mikroenjektörü tetiklemek, elektroporasyon yapmak ve odaklanmak için ayak pedalları kullanılır. Cerrahi kapsamdaki aletler bir otoklavda sterilize edilir. Aletler, fareler arasında cam boncuk sterilizatörü kullanılarak veya iğne tutucu yeniden otoklavlanarak yeniden sterilize edilmelidir.

Balli makas, halka pens ve vasküler pensler temel araçlardır. Ventral orta hat insizyonu yapın, cildi vasküler pens ile tutun ve integumenti uçları yuvarlatılmış makasla eksize edin, insizyonu 10 ila 14 Millimeters mesafeye uzatın. Linea alba olarak adlandırılan beyaz avasküler bağ dokusu bandını ve abdomenin ventral orta hattını tanımlayın, linea albayı uçları yuvarlatılmış makas ile kesin.

Bağırsağa veya inguinal yağ yastıkçıklarına zarar vermemeye dikkat ederek; karnı derhal steril, önceden ısıtılmış laktatlı ringer çözeltisi ile yıkayın. Ciltteki ve karın duvarındaki insizyon bölgelerini kanama açısından değerlendirin.

Varsa, künt penslerle yapılan direkt baskı hafif kanamayı durduracaktır; sağ ve sol uterus kornularını halkalı uçlu penslerle dışarı çıkarın. Sağ uterus kornusunu pensin halkalı bir ucuyla nazikçe yakalayın ve uterusu orta hat insizyonuna doğru çekin. Uterusun kancalanmasını kolaylaştırmak için boşta kalan elinizle dişinin yan tarafını nazikçe manipüle edin.

Pensler, rahimi sıkıştırmak ve dışarı çekmek için asla kullanılmamalıdır. Bu işlem rahim damar yapısına veya embriyolara zarar verebileceğinden, dışsallaştırma prosedürünü sol rahim kornusu için tekrarlayın. Dışsallaştırılan rahim kornuslarını derhal önceden ısıtılmış lakte Ringer çözeltisi ile yıkayın ve rahimle birlikte dışarı çıkmışlarsa inguinal yağ pedlerini veya bağırsakları nazikçe geri yerleştirin.

Bu durumla sık karşılaşılmaz. İkinci bölüm: uterine mikroenjeksiyon. Anne hayvan, uzun çalışma mesafeli objektifin altına yerleştirilir ve yumuşak kablolu bir fiber optik ışık uterine duvara karşı konumlandırılır.

Embriyonun yöneliminin belirlenmesini kolaylaştırmak için uterus, boşta kalan elin bir parmağıyla hafifçe bastırılır. Fiber optik kablodan gelen ışık, embriyo yönelimini doğru şekilde değerlendirmek için gereken en düşük yoğunlukta olmalıdır.

Yoğun ışık, uterusa ısı ileterek komplikasyonlara neden olabilir. Fiber optik ışığı ve uterusu bir elimizle tutarken, boşta kalan elimizdeki bir parmağı kullanarak embriyoyu nazik palpasyon ile yeniden konumlandırıyoruz. Aşağıdaki üç video microscopy EC klibinde ve uterusta gözlemlenen yaygın embriyo oryantasyonlarını gösteriyoruz.

İzleyici, trans-aydınlatma sırasında gördüğümüz mikroskobik görünümü görecektir; ancak siyah beyaz trans-aydınlatma, uterusun içindeki embriyonun in vivo oryantasyonunun tespit edilmesine olanak tanır. Bu örnekte embriyo, ventral yüzeyi izleyiciye dönük olacak şekilde baş aşağı pozisyondadır. Uterusu ileri geri hareket ettirerek sağ ve sol arka üyeleri, kuyruğu ve sol göz kefalonunu tespit edebiliriz.

Bu Örnekte, embriyo yine baş aşağı pozisyondadır ancak anterior posterior eksene göre yaklaşık 90 derece döndürülmüştür. Uterusu nazikçe ileri geri hareket ettirerek, sol arka ekstremiteyi ve sol ön ekstremiteyi tanımlayan kürek şekillerini görebiliriz. Arka beyin de belirgindir.

Embriyo, sol tarafı izleyiciye bakacak şekilde dik bir pozisyondadır. Oluşmakta olan dördüncü ventrikül, arka beyinde parlak bir bölge olarak tespit edilebilir. Sol göz sefalonu, sol ön ekstremite ve sol arka ekstremiteler de belirgindir.

Rahime uygulanan hafif baskı, beyaz ve siyah yıldızla sırasıyla işaretlenmiş olan primer baş veninin ana gövdesinin ve ön ve arka dallarının tespitini sağlamak için embriyoları hafifçe yeniden yönlendirir. Göreceğimiz üzere, Otis, primer baş veninin ön ve arka dallarının orta noktasında yer alır. Otis'in kendisi, transilüminasyon yoluyla uterus üzerinden görülemez.

İki ardışık video mikroskopi klibinde, embriyoyu Otis destek ünitesine mikroenjeksiyon için nasıl yeniden konumlandıracağımızı gösteriyoruz. Amaç, başın lateral bölgesinde otis konumunun belirlenmesine olanak tanıyan embriyonik işaretleyicileri tanımlamaktır. Temel amacımız, primer baş venini tanımlayabilmek için embriyoyu dorsal pozisyondan lateral pozisyona getirmektir.

Mezensefalon, dördüncü ventrikül ve sol ön ekstremite dorsal pozisyonda belirgindir. Uterusa uygulanan hafif basınç, embriyonun yönelimini dorsalden laterale kaydırır. Sol göz, sefalon, mezensefalon ve dördüncü ventrikül kolayca görülebilmektedir.

Yıldızla belirtilen primer baş veni ve onun posterior dalı da belirgindir. Primer baş veninin anterior dalı net bir şekilde saptanmamıştır. Amacımız, uterine mikroenjeksiyon için uygun olan daha yüksek büyütme altında primer baş venini tanımlayabilmek için embriyoyu yönlendirmektir.

Bu lateral perspektifte uterus damarları, decidual band ve sol göz görülmektedir. Uterusa uygulanan hafif basınç embriyonun pozisyonunu değiştirir, böylece dördüncü ventrikül ve sol göz tespit edilebilir. Asterik ile işaretlenmiş olan primer baş veni ve posterior dalı; primer baş veni ve dalları, Amerikan futbolu kale direklerinin şeklini oluşturur.

Otik vezikül uterus üzerinden görülemez, ancak desteklerin merkezinde yer alır. Lynn, bir embriyo için enjeksiyon sekansını başlatmıştır. Uterusu trans-illüminasyonla aydınlatır, mikroenjeksiyon için embriyoyu yeniden yönlendirir ve fast green ile doldurulmuş mikroenjeksiyon pipetini görüş alanına getirir.

Mikroenjeksiyon pipeti, bir X, Y, z mikro manipülatör tarafından tutulan bir pipet tutucuya takılıdır. Manipülatör manyetik standı, mikroenjeksiyon pipetinin zahmetsizce kaba konumlandırılmasına olanak tanıyan Teflon tabanlı bir çelik plakaya sabitlenmiştir. İğne, manipülatör üzerindeki ileri mikrometre kontrol düğmesi uygun şekilde kullanılarak ilerletilir.

Erken Otis evresindeki fare embriyosuna yapılacak travmatik mikroenjeksiyon için özel olarak hazırlanmış pipetler gereklidir. Yatay bir pipet çekici kullanarak kalın duvarlı borosilikat cam kapiler tüpleri çekeriz. A'da gösterilen sonuçtaki pipet, B'de ok ucuyla belirtilen yaklaşık 14 ila 16 mikron dış çap konumundan pensle manuel olarak kırılır. C'de gösterilen pipetin kaba kırılma yüzeyi pürüzlü ve kırılgandır.

Mikroenjeksiyon pipeti uçlarını keskinleştirmek için pipeti yaklaşık 20 derecelik bir açıyla eğimli şekilde kesiyoruz; Panel D'de görüldüğü üzere mikroenjeksiyon pipetlerinin çekilmesi ve eğimli kesilmesi için gerekli parametreler ek metinde sağlanmıştır. Sonraki iki video mikroskopi klibinde, embriyonik 11,5 ve 12,5. günlerdeki fare otik kistine mikroenjeksiyon işlemini gösteriyoruz. Amacımız, embriyonik 11,5. gündeki fare otik kistlerine uterus içi mikroenjeksiyonu göstermektir.

Öncelikle, doğru hedeflenmiş bir enjeksiyonun nasıl göründüğünü net bir şekilde göstermek için uterus mevcut değilken otikleri enjekte ediyoruz. Ardından, gerçek trans-uterin mikroenjeksiyonu gerçekleştiriyoruz. Bu ilk enjeksiyon için, visseral kesenin dışarı çıkmasına izin vermek amacıyla uterus boylamasına kesilmiş ve visseral vitellus kesesinin üzerindeki desidüal bant kaldırılmıştır.

Plasenta rahimle bağlantılı kalmaya devam eder ve embriyo canlıdır. Rahmin odaksal olarak çıkarılmasıyla dördüncü ventrikül, primer baş veni ve onun anterior ile posterior dalları, pipet ve beyaz renkte kistin yaklaşık konumu görülmektedir. Bu enjeksiyon dizisinin başlangıcında, visseral vitellus kesesi vaskülaritesinde kan akışı tespit edilir.

Pipet, visseral vitellus kesesi boyunca ilerletilir ve dai, osis notuna, dorsalde endolenfatik kanala ve otiklerin dikmelerin merkezindeki konumuna enjekte edilir. Otik, primer kafa veninin anterior ve posterior dallarının ortasındadır; embriyonik 11,5. gün fare otiklerine uterus içi mikroenjeksiyon yapılması, otik kistin konumunu tahmin etmek için primer kafa veninin ve dallarından en az birinin tespit edilmesini gerektirir.

Bu şematik örnekteki hedefimizde, primer baş veninin hem anterior hem de posterior dalları saptanmış ve OUC bölgesi beyazla işaretlenmiştir. Embriyonun daha gerçekçi bir sunumu, primer baş veninin ana gövdesinin dallarından yalnızca biriyle birlikte saptandığı durumdur ve gösterilen örnekte primer baş veninin yalnızca posterior dalı görülmektedir; ancak bu durum otiklerin konumunu yorumlamak için yeterlidir. PT uterus boyunca ilerletilir ve otiklerin içine boya enjekte edilir.

Boyanın amniyotik boşluktan temizlenmesi için 30 saniye bekleriz; bu noktada endolenfatik kanalı dorsalde ve vestibülü görebiliriz. Bu görünümde anatomik perspektif sağlamak amacıyla, az önce enjeksiyon yaptığımız embriyonun düşük büyütmeli bir görüntüsüyle işlemi tamamlarız; burada dördüncü ventrikül, sol göz ve uterus vaskülarizasyonu görülmektedir. Embriyonik 12. gündeki fare otik kistine trans- ve mikroenjeksiyon ile arka beynin yeni oluşan dördüncü ventrikülüne mikroenjeksiyonu gösteriyoruz.

Transillüminasyon, bu sol lateral görünümde primer baş veninin yanı sıra gözün de tespit edilmesine olanak tanır. Pipet, uterus üzerinden otik veziküle doğru ilerletilir ve lümenini doldurmak için boya enjekte edilir. Dördüncü ventriküle enjeksiyon yapmak için, arka beynin dorsal görünümünü elde etmek amacıyla embriyoyu 90 derece döndürürüz.

Enjekte edilen sol kist şu an sol taraftadır. Pipet uterus boyunca ilerletilir ve fast green ile lor karıştırılır. Konjuge dekstran dördüncü ventriküle enjekte edilir.

Enjekte edilen boya hacminin in vivo ortamda orta beyne girmediğine dikkat edin. Dekstran lokalizasyonunu dördüncü ventrikülde doğrulamak için enjeksiyondan sonra floresans değerlendirmesi yapılır. Ardından embriyo, dorsal pozisyondan lateral pozisyona yeniden yönlendirilir.

Bu lateral görünümde endolenfatik kanal, dördüncü ventrikülün hemen ventralindedir. In vivo floresan görüntüleme, dekstranın dördüncü ventriküldeki lokalizasyonunu doğrular. Doğumda, epi-floresan mikroskop kullanarak yavruların dördüncü ventrikülünde yeşil floresan olup olmadığını tarıyoruz.

Arka beyinlerinde yeşil floresan bulunan yavrular, embriyogenez üçüncü bölüm in vivo elektroporasyon sırasında manipüle edilmiş bir iç kulağa sahiptir. Kist ekspresyon plazmidi ile doldurulduktan sonra, uterus önceden ısıtılmış laktatlı ringer çözeltisi ile taze olarak yıkanır. Transillüminasyon, ODU kistinin elektrot alanında merkezlenmesini kolaylaştırır.

Fiber optik ışığın metal başlığı uterus yüzeyinden geri çekilir. Kare dalga darbe trenini başlatmadan önce, bir sonraki video mikroskopi klibinde in vivo tam bir elektroporasyon döngüsünü gösteriyoruz. Embriyonik gün 11,5 fare otik kistinin elektroporasyonu, palet tipi elektrotların uterusa nazikçe yerleştirilmesini gerektirir.

Bu örnekte, sol otik kist ekspresyon plazmidi ile doldurulmuş ve uterus taze laktatlı ringer çözeltisi ile yıkanmıştır. Katot, doldurulmuş otik kiste göre lateral olarak konumlandırılmış ve anot ise medial olarak yerleştirilmiştir; elektroporasyon sekansının başlangıcında otik kist, ped alanının merkezindedir. Uterus nazikçe sıkıştırılır ve kare dalga puls treni bir ayak pedalı anahtarıyla başlatılır.

İdeal olarak, darbe başına 60 ila yüz miliamper akım uygulanır. Ardından uterus serbest bırakılır ve derhal yıkanır. Yeni yıkanmış uterus, ring penset ile hafif baskı uygulanarak karın boşluğuna geri döndürülür.

Uterus içeri alındıktan sonra, abdominal kavite yaklaşık dört ml laktatlı ringer çözeltisi ile yıkanır; abdominal cerrahi sonrası normalden daha az su içecek olan damın hidrasyonunu korumaya yardımcı olmak için abdominal kavitede yaklaşık bir ml laktatlı ringer bırakılır. Karın duvarı ve ardından cilt, bir iğne tutucu kullanılarak emilebilir sütürle kapatılır. Kullandığımız iğne tutucunun, kapatma işlemini kolaylaştıran yerleşik bir makası bulunmaktadır.

Hem karın duvarı hem de deri için sürekli dikiş yöntemini tercih ediyoruz. İnsizyon bölgesinde ek destek sağlamak amacıyla her iki dikişte bir kilit atıyoruz. Anne hayvanı iyileşme kafesine yerleştirmeden önce cilt altına nonsteroid antiinflamatuar bir ilaç uyguluyoruz.

Kurumunuzun hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından hangi profilaktik analjeziklerin tercih edildiği konusunda veteriner personelinizle istişare edin. Anne hayvan, steril bir örtüye sarılarak ısıtmalı iyileşme kafesinin tabanına yerleştirilir. İyileşme kafesi; yuva malzemesi, gizlenme için kırmızı bir tüp, laboratuvar yemi ve bir su şişesi içerir.

Kafes, cerrahiden sonraki sabah üst kısmına bir filtre başlığı takılarak yeniden kurulur. Anne hayvan bakımlı görünmektedir, hareketlidir ve kafesin açık olan üst kısmını incelemek için arka ayakları üzerinde dengede durabilmektedir. Karındaki sütür hattı temiz ve kurudur; ayrılma, kızarıklık veya şişlik belirtisi göstermemektedir.

Utero gen transferi için hayvan bakım protokolü geliştirmeyi ele alan bir belge ekledik. Bu belge, hayvan bakım ve kullanım komitenizle istişare ederek kuruma özgü bir protokol tasarlarken faydalı olabilecek ifadeler içermektedir. Dördüncü bölüm, temsilci sonuçlar.

Temsili sonuç panelleri A ve B, embriyonik 11,5. günde Otis'e geliştirilmiş yeşil floresan protein ekspresyon plazmidi enjekte edilen ve ardından elektro- işlemi uygulanan, postnatal altıncı günündeki bir yavrudan alınan temsili bir kokleayı göstermektedir. Koklear yan duvar, orta kısımdan ve apeksden çıkarılmıştır. Sadece kokleanın bazal kısmından orta kısmına kadar GFP ekspresyonu mevcuttur ve bu ekspresyon, panel B'de gösterilen tüy hücresi markeri myosin seven A'nın dağılımını takip etmektedir. Panel C, embriyonik günün düşük büyütmeli konfokal projeksiyonunu göstermektedir.

18.5 günlük fare organi di Corti, myosin seven A antikoru ile immün boyanmıştır; transfekte hücreler organi di Corti boyunca dağılmıştır. Panel D, embriyonik 18.5 gün fare organi di Corti'nin cin.Seven ile boyanmış yüksek büyütmeli konfokal projeksiyonunu göstermektedir.

İç ve dış tüy hücrelerinde, interphalangeal hücrelerde, sütun hücrelerinde ve TER hücrelerinde GFP ekspresyonu tespit edilir. Embriyonik gün 11,5'te Otis'e gerçekleştirilen elektroporasyon aracılı gen transferi, cochlea organı içindeki tüm bileşen hücre tiplerini oluşturan progenitörleri transfect eder.