Virüs tabanlı Cre Rekombinasyon kullanarak Postnatal Fare Beyin Gelişimi Gen Fonksiyonu Mosaic Analizi

Bu prosedürün genel amacı, beyin gelişiminin postnatal döneminde gen fonksiyonunu manipüle etmektir. Bu işlem; öncelikle uygun virüslerin seçilip hazırlanması, şırıngaya doldurulması ve enjeksiyon ekipmanının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından virüs, yeni doğmuş fare yavrularının beyinlerine enjekte edilir ve son adım olarak hayvanlar sakrifiye edilerek enjekte edilen bölgelerin görüntülemesi yapılır.

Nihayetinde, immunofloresan mikroskopi aracılığıyla kontrol ve nakavt hücrelerin farklı şekilde etiketlendiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, postnatal gelişim döneminin genetik olarak nasıl düzenlendiği gibi nörobilim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Enjeksiyon için, çok sayıda hücreyi manipüle etmek amacıyla, genellikle mililitrede 10¹² genom kopyası olan tam titreli, ticari olarak temin edilebilen bir adeno-ilişkili virüs çözeltisi kullanılabilir.

Seyreltme veya etiketleme isteniyorsa, 1/10'luk bir dilüsyon ile başlayın. Virüsü buz üzerinde çözdükten sonra, ön dilüsyon hacmini derhal steril bir 250 microliter PCR tüpüne aktarın. Dilüsyonu buz üzerinde tutun.

Uygun bir şırınga seçip bunu bir yükleme iğnesine bağlayarak enjeksiyon pompasını hazırlayın. Ardından, şırıngada çok küçük bir hava kabarcığı görülene kadar virüs solüsyonunu nazikçe çekin; bu adımı kolaylaştırmak için inert yükleme boyası kullanılabilir. Şimdi şırıngayı bir tutucu ile pompaya sabitleyin.

Ardından, şırınga ile iğne tutucu arasındaki bağlantı borusunu nazikçe takın. Enjeksiyon iğnesinin, iğne tutucunun içindeki bağlantı borusuyla doğrudan temas ettiğinden emin olun. Şimdi, iğne ucunda küçük bir çözelti damlası görünene kadar çözeltiyi bağlantı borusu boyunca yavaşça ilerletin.

Pompa üzerindeki bir braket ile pistonu, itici blok yanına dikkatlice sabitleyin. Enjeksiyon hızını dakikada sekiz µL olarak ve enjeksiyon hacmini 1 ile 2 µL arasında ayarlayın. Ardından, pompanın şırınga çapı ayarını kullandığınız şırınganın çapına uygun olacak şekilde düzenleyin.

Son olarak, yavru fareleri iyileşme aşamasında korumak için ısıtıcı tablayı 38 °C'ye ayarlayın ve üzerine bir kağıt havlu örtün. IACUC onaylı bir protokol kullanarak, P0 veya P1 fare yavrularını soğuk anestezi uygulayarak enjeksiyona hazırlayın. Birkaç kağıt havluyu suyla nemlendirin ve buzun üzerine yerleştirin.

Ardından, dört veya beş yavruyu kağıt havlu üzerine birbirlerinden ayrı olacak şekilde yerleştirin. Kağıt havluları yavruların üzerine doğru nazikçe katlayın, kağıt havluların üst kısmına az miktarda kırık buz yerleştirin ve yavruları yaklaşık beş dakika boyunca inkübe edin. Yavrular güvenli bir şekilde 15 dakikaya kadar buz üzerinde tutulabilir ve yine de sorunsuz bir şekilde iyileşebilirler.

Şimdi, enjeksiyon bölgesine en iyi erişimi sağlamak için anestezi uygulanmış yavruyu bir sabitleme bloğuna yerleştirin. Örneğin, kortekse en kolay erişim, hayvan karnı üzerine düz bir şekilde yatırılarak sağlanır. Yavru bir yara bandı yardımıyla sabitlenebilir; yavrunun başını manuel olarak stabilize edin ve hareket etmesini önlemek için deriyi gergin tutun.

Ardından, lambda suturu gibi kafatası anatomik işaretlerini belirleyin ve diğer elinizle tekrarlanabilir bir enjeksiyon noktası seçerek iğneyi nazikçe kafatasından içeri yerleştirin. İğne kafatasına kolayca nüfuz etmezse sertçe itmeyin. Bunun yerine, iğnenin konumunu değiştirin ve nazikçe tekrar deneyin.

Korteks için enjeksiyon derinliği, bireysel hayvanlar ve suşlar arasında hafifçe farklılık gösterir; genellikle yarım ila bir milimetre derinlik yeterli olur. Şimdi, el hareketlerini en aza indirmek için bir meslektaşınızın pompayı çalıştırmasını sağlayarak virüs solüsyonunu enjekte edin. İdeal olarak, enjeksiyondan sonra pompayı başlatmak için bir ayak pedalı kullanılabilir.

İğneyi birkaç saniye boyunca yerinde tutun, ardından yavru köpeğin başını sabit tutarak iğneyi yavaşça çıkarın. Şimdi, yavru köpeğin örtülü sıcak plaka üzerinde beş ila 10 dakika boyunca iyileşmesine izin verin.

Bu süre zarfında, diğer yavruları enjekte etmeye devam edin. Tüm yavrular pembe renklerini geri kazandığında ve hepsi hareket etmeye başladığında, onları ev yuva malzemelerinin bir kısmıyla nazikçe ovalayın. Ancak bu aşamadan sonra annelerine geri döndürülebilirler.

Aksi takdirde, yabancı yavrular olarak algılanabilirler ve anne, yavrular kendisine geri döndürüldükten sonra onları büyük olasılıkla öldürür. Enjektörü tamamen aseton veya %70 etanol ile doldurarak enjeksiyon düzeneğini temizleyin. Sano, akurat veya yapıştırıcılar gibi asetona duyarlı bileşenler kullanılıyorsa, her seferinde taze çözelti kullanarak çözeltiyi enjeksiyon düzeneğinden birkaç kez geçirin.

Bu işlem, kalan tüm virüs solüsyonunu ve çökelekleri uzaklaştıracak ve çözücüler buharlaşacaktır. Sistemi yıkadıktan sonra, bir sonraki deneyciye hazır hale getirmek için çalışma alanını çamaşır suyu ile dezenfekte edin. Başarılı bir teknik, enjeksiyon bölgesinde güçlü bir nöronal enfeksiyon sağlar.

Korteks ve superior kollikulus gibi spesifik bölgelere yapılan enjeksiyonlar, genellikle komşu bölgelere minimum yayılım gösteren lokal enfeksiyonlar oluşturur. Yüksek titreli bir virüs çözeltisi kullanmak, hipokampus gibi komşu alanların enfeksiyon olasılığını artırırken; düşük titreli bir virüs çözeltisi ile yapılan enjeksiyon, genellikle orta hatta yapılan serebellar enjeksiyonlarda olduğu gibi enjeksiyon bölgesinin yakınında seyrek enfeksiyona yol açar. Enfekte olan hücre sayısı, enjekte edilen viral çözeltinin titresi ile korelasyon göstermelidir.

Örneğin, farklı floresan proteinler eksprese eden iki farklı AAV8 virüsünün yüksek titreli çözeltilerinin bir karışımının serebelluma enjekte edilmesi, farklı şekilde etiketlenmiş birçok kinji hücresini enfekte eder. Aksine, düşük titreli bir virüs çözeltisinin enjekte edilmesi, tekil hücrelerin görselleştirilmesine yardımcı olmak için seyrek enfeksiyonla sonuçlanabilir. Floresanla etiketlenmiş nöronlar, taze kesilmiş canlı dokuda doğrudan gözlemlenebilir veya immün boyamaya tabi tutulabilirler.

Bu işlem, geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu ile daha sonra yapılacak görüntüleme için endojen floresan sinyalleri güçlendirir. Son olarak, RAAV sekiz, korteksteki çeşitli nöron tiplerini enfekte etme ve ince uzantıları güçlü bir şekilde işaretleme kapasitesine sahiptir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık 30 dakikada tamamlanabilir.