Aktif Hücre Kültürü Şekil Bellek Polimerler

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri zamanla değişen bir topografyaya sahip bir substratta kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle bir şekil hafızalı polimerin hatırlanabilecek kalıcı bir şekle programlanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından şekil hafızalı polimer, hücrelerin daha sonra üzerine ekildiği geçici bir şekle programlanır.

Prosedürün son adımı, sıcaklığı artırarak şekil hafızalı polimerin kalıcı şekline dönmesini tetiklemektir; sonuç olarak, floresan mikroskobu aracılığıyla hücre davranışındaki değişikliği gösteren bulgular elde edilebilir. Merhaba, ismim Pat Mather. Syracuse Üniversitesi'nde biyomedikal ve kimya mühendisliği profesörü ve Syracuse Biyomalzemeler Enstitüsü direktörüyüm.

Bu tekniğin, hücreleri germek için kullanılan ticari veya özel düzeneklere göre temel avantajı, tek bir polimerik sistem içinde hücrelere çok çeşitli ve karmaşık gerilmeler uygulayabilmemizdir. Ben Jay Henderson. Biyomedikal ve Kimya Mühendisliği bölümünde yardımcı doçentim ve Syracuse Biyomalzemeler Enstitüsü üyesiyim.

Bu yöntem, hücrelerin fiziksel çevrelerindeki dinamik değişikliklere nasıl tepki verdiği gibi Mekanobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Benim adım Kevin Davis; Syracuse Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği ve Kimya Mühendisliği Bölümü'nde doktora öğrencisiyim. Bu yöntem 2D mekanik biyoloji hakkında içgörü sağlayabilse de, doku mühendisliği için 3D şekil değiştiren iskeleler gibi diğer sistemler için de kullanılabilir.

Bu prosedüre başlamadan önce; bir lam, bir milimetre kalınlığında bir Teflon ara parçası ve bir alüminyum plaka kullanarak özel bir kürleme odası hazırlayın. Odayı küçük ataçlarla sabitleyin; ardından, 18 gauge bir iğne kullanarak Teflon ara parçadaki bir delikten içeriye NOA 63 enjekte edin. Daha sonra odayı 125 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerine yerleştirin.

Kamber ısıtmasının ardından, kamberin beş dakika boyunca tekdüze bir sıcaklığa ulaşmasını bekleyin. Bir UV lambasını cam yüzeyden 6,5 santimetre uzağa konumlandırarak NOA 63'ü 20 dakika boyunca kürleyin. NOA 63'ü henüz sıcakken bir jilet yardımıyla kamberden çıkarın.

Ardından, şekil hafızalı polimeri doğrudan 125 °C sıcaklıktaki ısıtıcı tabla üzerinde üç saat 40 dakika boyunca UV ışığı altında son kürleme işlemine tabi tutun. NOA 63'ün şekil hafızasını karakterize etmek için, kürlenmiş filmi özel bir zımba ile sıcak presleyerek dambıl şeklinde bir numune hazırlayın. Son olarak, numuneyi çekme aparatına sahip bir dinamik mekanik analizöre yerleştirin.

Cihazı kuvvet kontrollü moda ayarlayın ve bu videoya eşlik eden yazılı protokolde yer alan test prosedürünü programlayın. Prosedürün sonucu, izotermal olarak kürlenmiş şekil hatırlamalı polimer veya SMP filmdir; modülü düşürmek ve kesimi kolaylaştırmak için CSMP'yi bir ısıtıcı plakaya yerleştirin ve sıcaklığı cam geçiş sıcaklığının üzerine ayarlayın. İzotermal olarak kürlenmiş SMP filmden münferit numuneler hazırlamak için.

S ve P filmini bir jilet yardımıyla istenen numune boyutunda kesin. Geçici şekil birçok farklı yolla sabitlenebilir. Burada, geçici bir topografya oluşturmak (emboss etmek) için ısıtılabilen ve soğutulabilen plakalara sahip bir masaüstü hidrolik pres kullanılmaktadır.

İlk olarak, PLA'ların sıcaklığını Tg'nin üzerindeki bir sıcaklığa ayarlayın. Bu gösterim için, paralel oluklardan oluşan geçici bir şekil oluşturmak amacıyla bir plak üzerine epoksi kürleyerek bir kalıplayıcı hazırlanmıştır. Kalıplayıcı diğer malzemelerden ve farklı topografyalarda yapılabilir, ancak NOA 63'ten daha sert olmalıdır.

Kabartma sıcaklığında s ve p numunelerini yüzleri aşağı bakacak şekilde kabartma makinesine yerleştirin. Ardından numuneleri ve kabartma makinesini prese yerleştirin. Isıtıcı PLA'lar ile numuneler arasında temas sağlamak için yaklaşık 100 kilo pascals ön yükleme uygulayın ve numunelerin homojen bir sıcaklığa ulaşması için yaklaşık beş dakika bekleyin.

Uniform bir sıcaklığa ulaşıldığında, örneklere bir ila altı megapaskal uygulayın ve bir dakika boyunca tutun. SMP kırılacaktır. Eğer daha yüksek bir stres uygulanırsa.

Daha küçük genlikli topografyalar oluşturmak için daha düşük stresler uygulayın. Basınç uygulandıktan sonra, pres plakalarının su soğutma özelliğini kullanarak sıcaklığı TG'nin altına düşürün. Sıcaklık tg'nin altına indiğinde, aktif hücre kültürü deneyine başlamadan önce uygulanan kuvveti kaldırın.

Biyolojik güvenlik kabininin UV ışığı, örnekleri sterilize etmek için kullanılır. Örnekleri kapaksız steril kaplara yüzleri aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve UV ışığını altı saat boyunca açık bırakın. Ardından örnekleri, yüzleri yukarı bakacak şekilde yeni steril kaplara aktarın.

UV ışığını altı saat daha açık tutun. Örneklerin, hücrelerle ekim yapmadan önce nispeten stabil bir duruma gelmesi gerekir. Örnekleri 96 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve 150 µL komple büyüme besiyeri ekleyin.

Kuyu başına besiyeri. Plakayı, istenen kısmi iyileşmeye ulaşana kadar 5%CO2 içeren 30 derece Celsius'luk bir inkübatöre yerleştirin. Bu demonstrasyon için, hücreleri hizalamak adına yeterli genliğin oluşması için örnekler 30 saat boyunca inkübe edilir.

Kısmi geri kazanım sağlandıktan sonra, örnekler hücrelerle ekilebilir. Örnekleri yeni bir 96 kuyucuklu plakaya yerleştirin. Ardından, buradaki her bir örneğe 150 µL hücre çözeltisi ekleyin, C3 H 10 t ve yarısı.

Embriyonik fibroblastların çoğu mililitre başına 20.000 hücre olarak kullanılır. İzole hücreler elde etmek için, hücreleri 30 °C'de 9,5 saat inkübe ederek geçici topografyaya tutunmalarına ve yayılmalarına izin verin. Ardından, örnekleri alıp boyama ve floresan görüntüleme işlemlerini gerçekleştirerek, geçiş öncesinde hücre morfolojisini analiz edin.

Bu materyal, UV ve görünür ışık spektrumunun büyük bir kısmında otofloresans sergiler; arka plan gürültüsünü azaltmak için spektrumun uzak kırmızı ucundaki Alexa Fluor 647 gibi floroforların kullanılması önerilir. Örneklerin toparlanmasını sağlamak için plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre taşıyın ve kültüre 19 saat boyunca devam edin. Bu işlem, materyalin toparlanmasına ve hücrelerin morfolojilerini yeni topografyaya uyarlamalarına olanak tanır. İnkübasyonun ardından, filamentli aktin görüntüleme için phalloidin gibi uygun boyaları uygulayın.

Son adım olarak, hücreler yeni topografya üzerinde görüntülenebilir; burada gösterilen, tek bir NOA 63 kürlemesinin dökme tek yönlü şekil hafızasıdır. Yıldız işaretinin deneysel kürleme başlangıcını belirttiği işlem üç kez tekrarlanmıştır. NOA 63, mükemmel şekil hafıza özelliklerine sahip, şeffaf, camsı bir katıdır.

Bu durumda malzeme kürlenmişti ve depolama modülündeki düşüşün başlangıcından belirlendiği üzere 51,1 °C'lik tek tip bir TG göstermiştir. Burada görülen gerinim düşüşü, ölçülen tg değerinde meydana gelmektedir. Uygulanan %4,7'lik gerinimin büyük bir kısmı, yük boşaltıldıktan sonra 20 °C'de sabitlenmiş olup bu durum %89,3'lük bir sabitleme oranına karşılık gelmektedir. Sabitlenen gerinim daha sonra ısıtma sırasında nispeten küçük bir sıcaklık aralığında %84,4'lük bir oranda geri kazanılmıştır.

Tüm eğrilerin neredeyse tamamen aynı yolu izlediği görüldüğünden, şekil hafıza performansının üç döngüye kadar herhangi bir bozulma göstermediği kanıtlanmıştır. Geçici topografyanın genliği, 30 °C'de 30 saat boyunca zamanla azalmaktadır. 30 °C'de.

Genlik, burada zaman sıfırında belirtildiği üzere yaklaşık %50 oranında azaltılmıştır. Sonraki 9,5 saat boyunca %10 daha azalır. Sıcaklığın 37 °C'ye yükseltilmesiyle geri kazanım tetiklendiğinde, kullanılan kabartıcı ve 4,9 megapascals'lık bir kabartma gerilmesi için genlik, 9,5 saat içinde başlangıç genliğinin %0,5'ine iner.

Bu durum, 13 mikrometrelik olukların neredeyse düz bir yüzeye dönüştüğü fonksiyonel bir değişime karşılık gelir. Bu polimer, hücre kültürü koşulları altında 30 ila 37 derece sıcaklık aralığında geri kazanım sağlar. Bu durum, kültür ortamından su alımından kaynaklanmaktadır; su polimeri plastikleştirerek Tg'yi düşürür ve böylece 51 derecelik kuru TG'nin altındaki sıcaklıklarda geri kazanımın gerçekleşmesine olanak tanır.

Aktif hücre kültürü substratlarının kullanımı aracılığıyla kontrol edilen bir hücre davranışı örneği, geçici oluklu substratlar üzerindeki hücre iskeleti organizasyonundaki değişimdir. Toparlanma tetiklenmeden önce, aktin mikrofilamentleri olukların yönü boyunca hizalanır. Sıcaklık artışıyla sağlanan toparlanmadan sonra, mikrofilamentler yeniden organize olmuş ve rastgele yönlenmiş durumdadır.

Buna karşılık, statik, düz veya statik oluklara sahip kontrol örnekleri sıcaklık artışından sonra yeniden organize olmazlar. Bu prosedürü uygularken; kürleme odasının geometrisinin, polimerin geçiş sıcaklığının, gerinim sabitleme yönteminin ve polimerin kendi bileşiminin, bu prosedürü takip eden kendi deneyinizde istenen geçişi sağlamak için ayarlanabileceğini unutmamak önemlidir. Geliştirilmesinin ardından, substrattan gelen mekanik stimülasyona yanıt olarak gen ekspresyonunun nasıl değiştiği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler kullanılabilir.

Bu teknik, hücre mekanobiyolojisi alanındaki araştırmacıların hücre hücre iskeletini, yeniden düzenlenmesini ve yumuşak madde fiziğini iki boyutta incelemelerinin önünü açmıştır. Çalışmamıza gösterdiğiniz ilgi için teşekkür eder, izlediğiniz için teşekkürler.