Protein Therapeutics İmalat Hücre Hatları Kalkınma Yüksek throughput Otomatik Platformu

Bu prosedürün genel amacı, klonallığa sahip ve yüksek üretkenliğe sahip biyolojik ürünler için üretim hücre hatları geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle konak hücrenin ilgili geni kodlayan DNA ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, yüksek üreten klonların faktörler aracılığıyla izole edilmesi ve ardından klon seçim görüntüleyici (clone select imager) ile koloni oluşumunun belgelenmesidir.

Son adım, yüksek verimli klonların taranması ve seçilmesidir. Nihayetinde, ters faz HPLC aracılığıyla sürekli ve beslemeli kesikli kültürlerde antikor üretimi olduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntemin gösterimi oldukça önemlidir; çünkü hücre ayıklama ve pcan 80 dgl adımları, prosedürlerin karmaşık bir kurulum içermesi nedeniyle öğrenilmesi zor aşamalardır. Bir laboratuvardan gelen şu bilim insanları; konak hücre efektinin transfeksiyonu için Jason Sanders, koloni oluşumunun belgelenmesi için hücre ayıklama ve tecan örneklemesi için Russell Kan bu prosedürleri uygulamalı olarak göstereceklerdir.

Bu prosedüre başlamak için, transfeksiyondan bir gün önce konak hücreleri 15 mililitre büyüme ortamı içeren bir hücre kültürü flaskına ekleyin. Hücreleri 37 °C, %7,5 CO2 inkübatöründe inkübe edin. Ertesi gün, transfeksiyon komplekslerini hazırlayın; önce 8 µg DNA'yı steril bir mikro santrifüj tüpünde 800 µL serumsuz büyüme ortamı ile seyreltin ve nazikçe karıştırın. Ardından, 40 µL lipofektini bir polistiren tüpte 800 µL serumsuz büyüme ortamı ile seyreltin.

Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş Lipofectamine'e ekleyin. Nazikçe karıştırın ve konak hücreleri transfeksiyona hazırlamak için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Büyütme ortamını hücrelerden uzaklaştırın ve yerine 6,4 mililitre serumsuz büyütme ortamı ekleyin.

Transfeksiyon komplekslerinden 1.6 mililitre flaska ekleyin. Flaska sallayarak nazikçe karıştırın. Hücreleri, bir karbondioksit inkübatöründe 37 derecede altı saat boyunca inkübe edin.

Altı saat sonra, erlene sekiz mililitre büyüme besiyeri ekleyin ve bir karbon dioksit inkübatöründe 37 °C'de ertesi güne kadar inkübe edin. Besiyerini aspirasyonla uzaklaştırın ve erlene taze büyüme besiyeri ekleyin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından hücreleri bir kez daha gece boyunca inkübe edin.

Büyüme ortamını seleksiyon ortamı ile değiştirin. Hücreleri, bir karbondioksit inkübatöründe 37 °C'de iki ila üç hafta boyunca inkübe edin. Transfeksiyondan iki ila üç hafta sonra hücreler, akış sitometrisi ile aktive edilmiş hücre sıralaması (FACS) yoluyla klonlanmaya hazır hale gelir; hücreleri flasktan ayırın ve 4 °C'de beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjleyin.

Hücreleri, %2 sığır serum albümin ile desteklenmiş seleksiyon ortamında yeniden süspande edin. Ardından florasanla işaretlenmiş anti-insan IgG antikoru ekleyin. 1/20 dilüsyonunda ekleme yapın, 15 ila 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve ardından soğuk PBS ile iki kez yıkayın; hücreleri bir polipropilen tüp içerisinde 1X PBS ile yeniden süspande edin.

Boyanmış hücrelerin bir örneği bu resimde gösterilmiştir; BD FACS Aria üzerinde aseptik ayıklama için, her kuyucuğunda 200 µL seçim ortamı içeren bir 96 kuyucuklu hücre kültür plakası hazırlayın. Hücrelerin bulunduğu tüpü aseptik olarak yükleyin ve BD FACS Aria cihazında analiz edin; boyanmış ve boyanmamış hücrelerin sonuçlarını sırasıyla kaydedin.

İstenen floresan boyama profiline sahip tek hücreleri 96 kuyucuklu plakaya ayrıştırmak için kapıları ve ayarları düzenleyin; plakayı 37 °C'lik bir inkübatörde iki hafta boyunca inkübe edin. Ayrıştırma işleminden sonra sıfırıncı, üçüncü, yedinci ve on üçüncü günlerde, tek bir hücreden türetilen klonların seçildiğinden emin olmak ve yüksek üretkenliğe sahip klonları tarayıp seçmek için 96 kuyucuklu plaktaki koloni oluşumunu bir klon seçim görüntüleyici ile belgeleyin. İlk olarak, alıcı 96 kuyucuklu analiz plakasındaki örnek konumunu belgeleyin. Ardından, 20 µL süpernatan alıkotlarını 96 kuyucuklu analiz plakasının her bir kuyucuğuna aktarmak için robotik bir sıvı aktarım sistemi kullanın; örneklerdeki antikor üretimi bir sandviç yöntemi ile analiz edilir.

Sıvı transfer sistemi üzerinde insan IgG saptama ELI SA işlemi şu şekilde gerçekleştirilir. İlk olarak, numuneler ve bir standart, önceden kodlanmış biyokaplama anti-insan IgG analiz plakalarına yüklenir. Plakalar oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edilir ve ardından üç kez PBS ile yıkanır.

Sırasıyla, 1:2000 dilüsyonda HRP işaretli immuno pure keçi anti-insan IgG plaklara eklenir ve plaklar oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edilir. Bir saat sonra plaklar üç kez PBS ile yıkanır ve ardından A BTS substratı eklenir.

Son olarak, plakalar, tespit için 405 nanometredeki absorbans kullanılarak bir plaka okuyucuda okunur. Bu otomatik platform kullanılarak, floresan işaretli anti-human IgG ile boyama tarafından yansıtılan yüzey antikor seviyesinin, hücrenin antikor üretkenliği ile korele olduğu bulunmuştur. Yüksek yüzey antikor ekspresyonuna sahip hücre popülasyonundan üretilen en iyi iki klon için burada gösterildiği üzere, spesifik üretkenlik hücre başına günlük 50 ila 70 pikogram arasında değişmekteydi.

Buna karşılık, düşük yüzey antikor ekspresyonuna sahip hücre popülasyonundan elde edilen en iyi iki klon için antikor üretkenliği günde hücre başına yaklaşık 20 pikogramdı. Ayrıca, FACS sıralama ile geliştirilen hücre hatları, manuel sınırlayıcı dilüsyon yoluyla klonlananlara göre antikor üretimi açısından daha stabildir. Manuel sınırlayıcı dilüsyon ile elde edilen en iyi klon olan klon birin spesifik üretkenliği, 80 hücre bölünmesi boyunca kültüre edildikten sonra yaklaşık 30 PCD'den yaklaşık 10 PCD'ye düşmüştür.

Öte yandan, FACS sıralamasıyla elde edilen iki numaralı klonun en üst alt klonu, özgül üretkenliği en az 100 hücre bölünmesi boyunca yaklaşık 20 PCD seviyesinde koruyabilmiştir. Floresan in situ hibridizasyon ile hücre kromozomundaki transgen entegrasyon bölgesinin belirlenmesi, bir numaralı klonun fenotip A ve fenotip B'den oluşan karma bir popülasyon olduğunu göstermiştir. Buna karşılık, FACS ile sıralanan klon, hücrelerin %99,5'inin fenotip A olduğu daha homojen bir popülasyon gibi görünmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, terapötik proteinlerin üretimi için üretim hücre hatlarının nasıl geliştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.