Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Burada sunulan tekniklerin genel amacı, erken gelişim sırasındaki morfogenetik deformasyonu ölçmek için embriyonik dokuları işaretlemek ve kültüre etmektir; erken evre tavuk embriyosu kültürü için, önce filtre kağıdı taşıyıcı yöntemi kullanılarak embriyoyu yumurtadan çıkarın. Deneysel uygulamaya bağlı olarak, çıkarılan embriyoyu manyetik demir partikülleri aracılığıyla iletilen floresan lipofilik boyalarla veya polistiren mikrokürelerle işaretleyin. Ardından, kültürleme sırasında işaretleyicileri floresan mikroskopi veya optik koherens tomografi görüntüleme kullanarak takip edin.

Elde edilen morfogenetik gerinim haritalarının görüntülenmesi, hem iki hem de üç boyutta doku uzaması, kısalması ve kayma bölgelerini göstermektedir. Merhaba, benim adım Ben Philis; Washington University in St.Louis Biyomedikal Mühendisliği Bölümü'nde Dr. Larry Tabor'un laboratuvarında lisansüstü öğrencisiyim. Bu tür deneylere başlamadan önce, model sisteminizdeki ilgili doku kültürü tekniklerini, erişebileceğiniz görüntüleme yöntemlerini ve ayrıca deneylerinizden elde etmek istediğiniz veri türünü göz önünde bulundurmanız önemlidir.

Örneğin, dokulardaki deformasyonları iki veya üç boyutta analiz etmekle mi ilgileniyorsunuz? Bugün burada, erken evre piliç embriyosunda iki tamamlayıcı etiketleme tekniği göstererek bu soruların bazılarını ele alacağız. Merhaba, ben Victor Varner; Washington University in St. Louis'te, Dr. Larry Tabor'ın laboratuvarında çalışıyorum.

Bu iki tekniğin her ikisinde de, erken dönem civciv embriyosundaki yüzlerce hücreyi hızlı ve eş zamanlı olarak işaretliyoruz. Bu işaretlerin hareketinin takibi, hücrelerin sonunda hangi dokulara yerleştiğini belirlememizi sağlamanın yanı sıra, erken embriyoyu şekillendiren doku düzeyindeki deformasyonu da nicelendirmemize olanak tanır. İlk olarak, yumurtaları Hamburger ve Hamilton tarafından tanımlanan istenen aşamaya gelene kadar boylamsal yönde inkübe edin.

Yumurtanın alt kısmını 150 milimetrelik bir Petri kabının kenarında kırın. Kabuğu alt kısımdan ayırarak yumurta içeriğini kaba boşaltın ve küt uçlu pens kullanarak, sarısının etrafındaki daha kalın ve viskoz albümini uzaklaştırın. Şimdi, dairesel bir filtre kağıdının ortasına delikler açın.

Filtre kağıdı halkalarından birini, embriyo halkanın merkezi deliğinden görünecek şekilde sarının üzerine yerleştirin. Filtre kağıdı halkasının dış çevresini mikro makasla kesin. Ardından, embriyonun yapışık olduğu kağıdı ince pensle sarıdan ayırın ve embriyoyu nazikçe bir PBS banyosunda bekletin. Yapışmış sarı parçacıklarını uzaklaştırmak için filtre kağıdı düzeneğini 35 mm'lik bir kültür kabına aktarın.

Embriyoyu ventral tarafı yukarı gelecek şekilde yerleştirin ve ikinci bir filtre kağıdı halkası ile sabitleyin. Bir metal halka ile sabitleyerek embriyoyu kültür ortamına daldırın. Embriyo tamamen suya batırılmazsa, anormal derecede yüksek yüzey gerilimi yükleri doku geometrisini ve ardından gelen morfolojenezi büyük ölçüde değiştirebilir.

Kültür sırasında, parlak alan mikroskobu kullanarak morfolojinin ve embriyonik evrenin uygunluğunu doğrulayın. İlk olarak, küçük bir miktar demir tozu alın, üzerine birkaç damla doygun boya ve alkol ekleyin ve çekilmiş bir mikro pipet ucuyla havada kurumaya bırakın. Kümelenmiş demir partiküllerini parçalayın ve bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

İyonize su ile birkaç kez durulama işleminden sonra, toplanan embriyoyu, bol miktarda kültür medyumu ile kaplanmış 35 milimetrelik bir kültür kabına sırt kısmı yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobunun altında, vitelin membranını kaldırmak ve elektrodermal hücreleri açığa çıkarmak için cam iğneyi kullanın. Şimdi, etiketlenmiş demir partiküllerinden oluşan bir sütunu bir mikro pipete çekin.

Diseksiyon mikroskobu kullanarak pipeti embriyonun hemen üzerine gelecek şekilde konumlandırın. Partikülleri embriyonun üzerine serpmek için pipeti parmak uçlarınız arasında yavaşça ileri geri yuvarlayın. 37 °C'de 10 dakikalık inkübasyonun ardından, partikülleri güçlü bir mıknatıs yardımıyla uzaklaştırın.

Gerektiğinde, mıknatısı ince uçlu manyetik bir penset setine tutturun ve kalan demir partiküllerini dikkatlice temizlemek için mıknatıslı penseti kullanın. Embriyonun hem brightfield hem de floresan görüntülerini almaya geçin. 22 gauge iğne ile.

PBS içindeki 10 mikrometre çapındaki siyah mikroküre çözeltisini 10 cc'lik bir şırıngaya çekin. Ardından, bir bilgisayar sabit sürücüsü kullanarak çekilmiş cam iğnelerin uçlarını eğimlendirin ve boncuk çözeltisi ile doldurun. Çözeltinin uca ulaşması için bir mikro manipülatör kullanarak mikro pipete hafifçe vurun.

Cam iğneyi embriyo ile aynı görüş alanına yerleştirin. Boncukların pipet ucundan akışını onaylayın. Şimdi pipet ucunu beyin tüpünün lümenine yerleştirin.

Dokunun ventral tabanını delmemeye dikkat edin. Boncuklar ve sıvı lümene girerken dokudaki geçici şişmeyi izleyin. Ardından cam iğneyi hızla çıkarın.

Son olarak, beyin tüpünün iç lümeninde yeterli boncuk yoğunluğu olduğunu doğrulayın. Parlak alan görüntüleri veya bir optik koherens tomografisi veri seti elde etmeden önce, boncukların çökelmesi için parlak alan mikroskobu altında 20 ila 30 dakika bekleyin. İlk görüntüleri elde ettikten sonra, numunelerin bulunduğu 7 adede kadar 35 milimetrelik kültür kabını 150 milimetrelik bir Petri kabına yerleştirin ve tüm düzeneği küçük bir plastik torbaya koyun.

Nemlendirme için torbaya deiyonize su damlaları ekleyin ve ardından torbayı %95 oksijen ve %5 karbondioksit karışımıyla doldurun. Embriyoları, bir sonraki görüntüleme zaman noktasına kadar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin; etiketlenmiş embriyoları 1,2 mL kültür ortamı içeren bir delta T kabına yerleştirin ve kabı 37 °C'de tutulan bir cam kapakla kapatın. Embriyoya mini pompa değişken akış cihazından sağlanan %95 O2 %5 CO2 gaz karışımı ile süperfüzyon uygulayın. Şimdi, istenen zaman aralıklarında otomatik olarak görüntüler alacak şekilde yazılımı ayarlayın.

Deney süresince etiketler otomatik veya manuel olarak takip edilebilir ve işaretçi koordinatları için morfogenetik gerinim haritaları hesaplanabilir. Burada, kafa kıvrımı oluşumu sırasında elektrodermal hücrelerin etiketlenmesi ve hareketlerinin takip edilmesi için demir partikül tekniği kullanılmıştır. Erken evre tavuk embriyosunda, floresanla işaretlenmiş hücreler embriyonun tamamına dağıtılmıştır.

Embriyonun parlak alan ve floresan görüntüleri, ex ovo kültürü sırasında farklı aralıklarla kaydedilmiştir. Bu işlem, izleme etiketlerinin hareketlerini takip etmek için yapılmıştır. Kümülatif veriler, baş kıvrımı oluşumu sırasındaki gelişen morfogenetik gerinim dağılımlarının hesaplanmasına olanak tanır.

Benzer şekilde, erken evre civciv beyninin orta arka beyin sınırındaki doku hareketlerini izlemek için polistiren mikrosfer tekniği kullanılmıştır. Boncukların beynin iç lümeninin tüm yanlarına yapışma eğiliminde olması nedeniyle, bu yöntemin belirgin şekilde 3B deformasyonları yönetebildiğine dikkat edilmelidir. Boncuk hareketleri altı saat boyunca izlendikten sonra, işaretleyici koordinatları, boylamsal ve çevresel yönlerdeki doku deformasyonunu karakterize eden gerinimlerin hesaplanmasına olanak tanır.

Bu videoyu izledikten sonra, kendi doku kültürünüzü ve etiketlemenizi gerçekleştirmek için gereken bazı deneysel basamaklar hakkında iyi bir fikir edinmiş olmalısınız. Burada sunulan protokol teknikleri, özellikle doğal dokular için minimum düzeyde invaziv olmaları, ayrıca düşük maliyetli ve kolayca temin edilebilen malzemeler içermeleri nedeniyle avantajlıdır. Bu deneyler, özellikle embriyonik gelişim mekaniği üzerine yapılan çalışmalar için oldukça kullanışlıdır.

Etiketli hücrelerin takip edilen hareketleri kullanılarak hesaplanan deformasyon alanları, morfogenezin fiziksel modellerini hem test etmek hem de oluşturmak için kullanılabileceğinden.