Canlı Hücre Görüntüleme Bacillus subtilis Ve Streptococcus pneumoniae Otomatik Zaman atlamalı Mikroskopi
28 Temmuz 2011
Bu protokol, otomatik floresan zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak zaman farklı bakteriler tek hücre davranışlarını izlemek için bir adım-adım yordam sağlar. Ayrıca, biz nasıl mikroskobu görüntüleri analiz etmek için yönergeler sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, hücre geçmişinin ve soy ağacının bakterilerin hücresel gelişimi üzerindeki etkisini inceleyebilmek için, canlı hücrelerin büyüme ve bölünme süreçlerini floresan mikroskobu ile görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin nispeten yüksek besin konsantrasyonuna sahip sıvı besiyerinden sıvı açlık besiyerine aktarılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, bakteriyel hücrelerin bir mikro koloni oluşturarak büyüyeceği bir mikroskop lamı hazırlanır.
Monotabaka hazırlanır. Ardından, zaman ayarlı (time-lapse) floresan mikroskopi videosu kaydedilir. Son olarak, video işlenir ve veriler analiz edilir.
Nihayetinde, zaman ayarlı floresan mikroskopi aracılığıyla tek bir bakteriyel hücrenin gelişimi gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu tekniğin, akış sitometrisi ve standart mikroskopi gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı; protein dinamiklerinin, hücresel davranışın ve tekil hücrelerin gelişimin zaman içinde izlenmesine olanak tanımasıdır. Prosedür, laboratuvarımdan doktora öğrencisi Cone tarafından gösterilecektir. B. subtilis hazırlamak için, -80 °C'deki stoklardan hücreleri, gerekirse antibiyotiklerle desteklenmiş 10 mL zaman ayarlı mikroskopi veya TLM besiyerine, steril çalkalama balonları içerisinde inoküle edin. Hücreleri bir gece boyunca 30 °C'de ve 225 RPM'de steril bir çalkalama balonunda büyütün. Ertesi sabah, hücreleri önceden ısıtılmış, antibiyotiksiz, kimyasal olarak tanımlanmış besiyerine veya CDM'ye 1:10 oranında aşılayın. B. subtilis hücrelerini, yaklaşık dört saat süren orta eksponansiyel faza kadar büyütün. Kültürün absorbansını 600 nm'de ölçün ve hücreleri yaklaşık 0,035 A$_{600}$ değerine seyreltin.
CDM kullanılarak. Bu OD, hücrelerin aralarında uygun boşluklar olacak şekilde tek tek mikroskop lamına damlatılmasını ve böylece zaman ayarlı (time-lapse) mikroskobinin gerçekleştirilmesini sağlar. Hücreler mid-eksponansiyel büyüme evresine ulaşmadan bir saat önce.
İki cam lamı %70 ethanol ve su ile temizleyerek mikroskop lamını hazırlayın. Gen çerçevesinin plastik kapaklarından birini, çerçevenin diğer tarafındaki plastik kapağın yerinden çıkmamasına dikkat ederek çıkarın. Gen çerçevesini, önce bir kenarını yapıştırıp ardından geri kalan kısmını bir tırnak yardımıyla yönlendirerek cam lamlardan birinin ortasına sabitleyin.
150 miligram yüksek çözünürlüklü düşük erime noktalı agarozun çözünmesi için mikrodalga fırın kullanın. Arka plan floresanını önlemek için agarozun 10 mililitre CDM içerisinde tamamen çözündüğünden emin olun. Isıtılmış agaroz CDM'den 500 mikrolitreyi, kenarlar da dahil olmak üzere tüm alanın tamamen kaplandığından emin olarak gen çerçevesinin ortasına pipetleyin.
Agarozun aşırı kurumasını önlemek için hızlı çalışın. Hava kabarcıklarını önlemeye çalışarak, ikinci lamı agaroz CDM ile doldurulmuş gen çerçevesinin üzerine yerleştirin. Agarozun yeterince katılaşması için sandviçi 45 dakika boyunca 4 °C'de yatay konumda bekletin.
Agar donduktan sonra, üstteki camı dikkatlice kaydırarak çıkarın. Bakterilerin büyüyeceği yaklaşık beş milimetre genişliğinde agar şeritleri kesmek için bir jilet kullanın. Her lamda, her iki yanından yaklaşık dört milimetrelik boşluklarla ayrılmış en fazla üç şerit kullanılabilir.
Bu boşluklar, Blu büyümesi için temel olan havayı sağlayacaktır. Yapışkan yüzeyi açığa çıkarmak için plastik örtülerin ikincisini ve sonuncusunu gen çerçevesinden dikkatlice kaldırın. Agros pedin üst kısmından başlayarak, pede dokunmadan, yaklaşık 2.5 µL sıvı içindeki tek hücreleri katı ortama yükleyin.
Pipet ucuyla, lamı yukarı ve aşağı eğerek besiyerinin eşit şekilde yayılmasını sağlayın. Lamelini tamamen yapıştırmak için gen çerçevesinin üzerine temiz bir mikroskop kapatıcı yerleştirin. Hücreler yüklendikten sonra basınç uygulamak için bir tırnak kullanın.
Hücrelerin yüzeyde kaymasını ve çok katmanlı büyümesini önlemek için sıvının yeterince kurumasını beklemek kritik önem taşır. Ancak, hücreler çok uzun süre kurutulursa, mikro kolon tek tabakası oluşturma aşamasında büyüme sorunları yaşayacaklardır. Bu nedenle, lamların kurutulması için gereken süre deneye bağlıdır ve sabit bir ölçüyle belirlenemez.
Ve sonuç olarak, kişi elbette buna karşı bir aşinalık kazanmalıdır. Zaman atlamalı (time-lapse) deneyin ilk saatlerinde otomatik odaklama sorunlarını önlemek için, zaman atlamalı mikroskobiye hazırlık amacıyla lamı 30 °C'de bir saat boyunca ön ısıtmaya tabi tutun. Çevresel odağı en az iki saat ön ısıtın. Deneye başlamadan önce, deneysel düzeneğinize uygun objektif filtrelerini ve dikroik aynayı seçin.
Uzun süreli deneyler için, ışık kaynağı ile numune arasına bir UV filtresi yerleştirildiğinden emin olun. Ayrıca, maruziyeti en aza indirmek için mümkünse nötr yoğunluk filtreleri kullanarak uyarım ışığının bir kısmını engelleyin. Deneyi, spesifik deneysel düzeneğe göre programlayın.
Asıl deneyden önce, belirli konstrüktler için gereken ışık miktarının yanı sıra diğer time-lapse mikroskoplar veya bakteriler için otomatik odaklama ayarlarının belirlenmesi faydalıdır. Daha kısa pozlama süreleri ve daha düşük eksitasyon ışığı seviyeleri, ağarmayı ve fototoksisiteyi en aza indirecektir. Otomatik odaklama fonksiyonu için mikroskobik ışık kullanın. Son olarak, hazırlanan lamı mikroskobun önceden ısıtılmış çevresel haznesine yerleştirin ve tek hücrelerin 30 °C'de bir mikro koloni tek tabakasına dönüşümünü izleyin.
Başarılı bir zaman ayarlı floresan deneyi, görüş alanı içerisinde tamamen yer alan bir mikro koloni monotabakası oluşturacaktır. Bu videodaki deneyin sonunda, solda parlak alan ve sağda floresans görülebilmektedir.
Burada, bazı hücrelerin birbirinin üzerine büyüdüğü ve bu durumun hem geçmişlerini doğru bir şekilde takip etmeyi hem de floresan seviyelerini doğru ölçmeyi zorlaştırdığı bir B Subtles mikro kolonisi örneği görülmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, zaman ayarlı (time-lapse) mikroskopi için mikroskobik bir örneğin nasıl başarıyla hazırlanacağı ve zaman ayarlı floresan mikroskopinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. BACE hücreleri ile deney yapınız.
Genel Bakış
Bu protokol, otomatik floresan zaman ayarlı mikroskopi kullanarak tekil bakteri hücrelerinin davranışlarının zaman içindeki değişimini izlemek için kullanılan bir yöntemi özetlemektedir. Protokol, numunelerin hazırlanması ve elde edilen görüntülerin analizine yönelik ayrıntılı kılavuzlar içermektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Mikroskobu
Arka Plan
- Bakteriyel hücre davranışını anlamak, çeşitli biyolojik çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Zaman serili mikroskopi, canlı hücre dinamiklerinin gözlemlenmesine olanak tanır.
- Bu yöntem, hücre geçmişinin gelişim üzerindeki etkilerine dair bilgiler sağlar.
- Geleneksel yöntemler, tek hücreli davranışın nüanslarını yakalayamayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Büyüme ve bölünme sırasında canlı bakteri hücrelerini görüntülemek.
- Besin koşullarının hücresel gelişim üzerindeki etkisini analiz etmek.
- Protein dinamikleri ve hücresel davranışlar hakkındaki anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Büyümeyi başlatmak için hücreleri açlık ortamına aktarın.
- Bakteriyel büyüme için bir mikroskop lamı hazırlayın.
- Zaman ayarlı floresan mikroskobu filmleri kaydedin.
- Hücre gelişimini gözlemlemek için kaydedilen verileri analiz edin.
Ana Sonuçlar
- Tekil bakteriyel hücrelerin zaman içindeki başarılı görüntülenmesi.
- Mikrokoloni oluşumunun ve gelişiminin gözlemlenmesi.
- Tekil hücrelerdeki protein ekspresyon dinamiklerine dair içgörüler.
- Time-lapse mikroskobinin geleneksel yöntemlere göre avantajlarının gösterilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, bakterilerdeki tek hücre davranışlarının etkili bir şekilde incelenmesine olanak tanır.
- Zaman geçirmeli mikroskopi, hücresel analizler için güçlü bir araçtır.
- Gelecekteki çalışmalar, diğer bakteriyel dinamikleri keşfetmek için bu yöntemi temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bakterilerde tek hücre davranışının izlenmesi; büyüme, bölünme ve protein ekspresyonundaki heterojenliği ortaya çıkararak antimikrobiyal hedef doğrulamanın mekanistik olarak riskten arındırılmasını sağlar. Hücresel geçmişi fenotipik sonuçlarla ilişkilendiren bu yaklaşım, erken keşif aşamasında öngörülebilir bir güven oluşturarak antibiyotik geliştirme için portföy önceliklendirmesine temel teşkil eder. Time-lapse mikroskopi, mekanistik taramadan preklinik model değerlendirmesine kadar translasyonel bir süreklilik sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Besin değişimlerine ve genetik pertürbasyonlara karşı bireysel hücre yanıtlarının zaman içindeki takibini yaparak terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Tekil hücrelerdeki protein dinamiklerinin ve hücresel davranışın doğrudan gözlemlenmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Hücresel soy ağacını nesiller boyunca fenotipik stabilite ile ilişkilendirerek öncü bileşik tanımlamasını destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Agaroz pedler üzerinde tekrarlanabilir mikrokoloni oluşumu sağlayarak, doğrulanmış biyolojik sistemleri sonraki bileşik taramaları için hazırlar.
- Kantitatif Çıktılar: Büyüme hızlarının, bölünme zamanlamasının ve protein lokalizasyonunun ölçülmesine olanak tanıyan, zamana bağlı floresan ve parlak alan verileri üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Standartlaştırılmış antimikrobiyal hedef değerlendirmesi için farklı bakteri türleri (B. subtilis, S. pneumoniae) genelinde platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalık İlişkisi: Antimikrobiyal etki mekanizması çalışmalarını bilgilendirmek için S. pneumoniae gibi klinik olarak ilgili türlerde patojen davranışını modeller.
- Translasyonel Biyobelirteç Uyumu: Tek hücreli protein dinamiklerini popülasyon düzeyindeki fenotiplerle ilişkilendirerek biyobelirteç odaklı devam/durdur kararlarını destekler.
- Risk Ayarlı İlerleme: Hedef etkilerini tek hücre çözünürlüğünde doğrulayarak preklinik modellerdeki mekanistik belirsizlikleri azaltır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, tek hücreli zaman ayarlı görüntülemeyi hedef doğrulaması ile öncü madde optimizasyonu arasına konumlandırarak, bileşik taraması öncesinde hipotez testine ve mekanistik risklerin azaltılmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: Gen ekspresyon dinamiklerinin büyüme ve bölünme sırasında hücresel davranışı nasıl etkilediğini görselleştirerek yolakların açıklanmasını destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için standardize edilmiş aralıklar ve tek tabaka oluşumuna sahip, analize hazır mikrokoloniler sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı koşul analizleri için floresans yoğunluğu, bölünme zamanlaması ve soy takibi dahil olmak üzere nicel bağımlı değişkenler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Patojen sistemlerde soy bağımlı davranış modellemesi aracılığıyla tek hücreli gözlemleri preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Gram-pozitif modellerde projeler arası antimikrobiyal hedef değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir bir mikroskopi kapasitesi oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Tek hücreli protein dinamiklerinin ve davranışsal heterojenliğin doğrudan gözlemlenmesi yoluyla hedef doğrulamasında öngörüsel güvenilirlik.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış lam hazırlama ve çevresel kontroller, laboratuvarlar ve deneysel çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hedeflerin popülasyon ortalamaları yerine tek hücreli yanıt tutarlılığına göre riskten arındırılmasıyla geliştirilmiş devam/durdur kararları.
- Portföy Etkisi: Popülasyon maskelemesinden kaynaklanan yanlış pozitifleri önlemek için soy hatlarıyla çözümlenmiş fenotipik veriler kullanılarak antimikrobiyal adayların risk ayarlı önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Mikrobiyal kültür teknikleri, floresan mikroskobisi ve ImageJ gibi görüntü analiz yazılımlarında uzmanlık gerektirir.
- Sıcaklık kontrollü çevresel odacıklara, nötr yoğunluk filtrelerine ve uzun süreli görüntüleme için UV korumasına bağımlıdır.
- Laboratuvarlar arası tutarlılık için lam hazırlama, agaroz konsantrasyonu ve hücre yükleme protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri, farklı bakteri türleri ve büyüme hızları için agaroz kalınlığının ve besin bileşiminin optimize edilmesini içerir.
- Pratik sınırlamalar arasında, uzun süreli görüntüleme sırasında fototoksisite riskleri ve çok katmanlı oluşumlarda büyüyen hücrelerin takibindeki zorluklar yer alır.
