Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Bu prosedürün amacı, bağışıklık hücrelerinin bakteriyel toksinlere verdiği yanıtları görselleştirmektir. İlk olarak, toksin BL 21 gold hücrelerinde eksprese edilir ve buralardan saflaştırılır. Toksin aktivitesi ve konsantrasyonu onaylandıktan sonra, toksin bağışıklık hücrelerine iletilir.

Bir mikro enjektör ve yüksek hızlı canlı hücre mikroskopisi uygulanır. Elde edilen görüntülerin analizi, bağışıklık hücresi yanıtlarının toksine karşı gerçek zamanlı kinetiğini ortaya koyar. Bu yöntem, inflamozom aktivasyon mekanizması gibi immünoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem, toksin aracılı bağışıklık hücresi yanıtları hakkında bilgi sağlayabilse de, kemotaktik çekiciler dahil olmak üzere diğer stimülasyonlar için de uygulanabilir. Bu yöntemle ilgili ilk fikri, bakterilerin kültürlenmiş bağışıklık hücreleriyle olan etkileşimlerini incelerken ve bakteriler ile bağışıklık hücreleri arasında oldukça değişken etkileşimler gözlemlediğimizde edindik. Strep lysin O veya SLO saflaştırmasına, PAG three SLO içeren BL 21 gold hücre kültürü ile başlayın.

Plazmid, yaklaşık 0.6 OD değerine ulaşana kadar büyütülür. Protein ekspresyonunu indüklemek için kültüre beş mililitre %20'lik OSes ekleyin ve oda sıcaklığında 225 RPM'de üç saat boyunca çalkalayın. Ardından, bakterileri 500 mililitrelik bir santrifüj şişesine aktarın.

Ardından, kültürü 4 °C'de 12 dakika boyunca 12,000 ×g'de santrifüjleyin; santrifüjleme işleminin ardından süpernatantı dökün. Peleti -80 °C'de gece boyunca veya gerekiyorsa daha uzun süre saklayın. Eksprese edilen SLO'yu saflaştırmak için, dondurulmuş pelete Triton X 100, lizozim ve fenilmetilsülfonil florür ile desteklenmiş 10 mL ly yıkama tamponu ekleyin ve yaklaşık 15 dakika boyunca pipetle aşağı yukarı çekerek karıştırın.

Resüspansiyon için, örneği buz üzerinde tutarak peleti süspande edin. Resüspande edilen peleti 50 mililitrelik bir oak ridge yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe aktarın. Lizatı, bir prob sonikatör kullanarak %40 çıkış gücünde, her biri 30 saniye süren beş kez, 30 saniyelik aralıklarla ve her işlem arasında 30 saniye buz üzerinde bekletilecek şekilde sonikasyona tabi tutun.

Ardından, sonike edilen lizatı 4 °C'de 20 dakika boyunca 39.000 ×g hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminin ardından, bakteriyel süpernatantı bir mililitre yıkanmış nikel NTA agarozlarına ekleyin. Nikel NTA agarozlarını ve lizatı, inkübasyon sonrası 4 °C'de hafif çalkalama ile 2,5 saat boyunca birlikte inkübe edin.

Boncukları 4 °C'de beş dakika boyunca 400 ×g hızda santrifüj ederek çöktürün. Aksi belirtilmedikçe, sonraki tüm yıkama ve elüsyon işlemlerinin bu santrifügasyon ayarlarıyla gerçekleştirildiğini unutmayın. Santrifügasyonun ardından.

30 µL süpernatantı, bir mikrosantrifüj tüpünde 10 µL 4x SDS örnek tamponu ile birleştirin ve saflık analizi için buz üzerinde saklayın. Daha sonra süpernatantın geri kalanını atın ve boncukları dört kez buz yıkama tamponuyla, ardından bir kez tuz tamponuyla yıkayın; her yıkama arasında santrifüj yapın. Bu noktadan itibaren, örneği her zaman buz üzerinde tuttuğunuzdan emin olun.

SLO oldukça redoks duyarlı bir proteindir ve kısa bir süreliğine bile 37 °C'ye ısıtılırsa aktivitesini hızla kaybeder. SLO proteinini elüe etmek için, boncuklara bir mililitre elüsyon tamponu ve beş mikrolitre bir molar DTT ekleyin, buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Ardından santrifüjleyin ve süpernatantı elüsyon numarasıyla etiketlenmiş bir santrifüj tüpünde toplayın.

Bu işlemi üç kez tekrarlayın, ardından SLO proteininden endotoksini uzaklaştırmak için numuneye res salt tamponu içinde süspanse edilmiş 200 µL yıkanmış poly mixing konjuge agro boncuk ekleyin ve 4 °C'de 30 dakika boyunca çalkalayın. Daha sonra 4 °C'de 10,000 ×g hızda bir dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı yeni etiketlenmiş mikro santrifüj tüplerine toplayın.

Her bir elüsyondan 30 µL'yi, 10 µL dört katı SDS örnek tamponu ile birleştirin. SDS-PAGE analizi için SLO çözeltilerini buz üzerinde saklayın. Protein konsantrasyonlarını ve hemolitik aktiviteyi belirleyin; sonuçlar tatmin ediciyse, SLOE'yi 5 ila 10 µL'lik alikotlar halinde çekin, ardından kuru buz üzerinde dondurarak -80 °C'de saklayın.

Ardından spesifik lizis miktarını belirleyin. Reese. Test edilecek hücreleri iki kez süspande edin. Mililitrede altı hücreyi, 20 mikrogram/ml içeren RB tamponu içinde merkezleyin.

Propidium iyodür. Burada T 27 A hücreleri test edilmektedir. Ayrı mikro santrifüj tüpleri kullanarak, 96 kuyucuklu V tabanlı bir plakanın her bir kuyuğuna 100 µL hücre ekleyin.

SLO'yu tampon rb içerisinde final konsantrasyonun iki katı olacak şekilde seri dilüsyonla seyreltin. Ardından, hücrelere ya 100 microliters toksin ya da 100 microliters tampon RB ekleyin ve 37 degrees Celsius'de beş dakika inkübe edin. Tipik final konsantrasyonlar 2000 units per milliliter ile 31.25 units per milliliter arasında değişmektedir.

Hücreleri bir akış sitometresinde analiz edin ve fi, cethrin veya pe filtreleri ile veri toplayın. Bir logluk kayma geçici olarak geçirgen hücreleri, üç logluk kayma ise ölü hücreleri temsil eder. Kontrol grubundaki ölü hücre yüzdesini deney grubundakinden, burada gösterilen denklemle çıkararak hücrelerin spesifik lizisini hesaplayın; deneyden bir gün önce, beş makrofajı iki kez kolajen kaplı cam üzerine merkezleyin.

35 milimetrelik alt tabanlı kaplar. Toksin iletimi için kullanılan mikroskop; ters çevrilmiş bir sahneye, ısıtmalı bir sahneye, uygun eksitasyon emisyon filtre küplerine ve eğer mevcutsa bir Bertrand lensine sahip olmalıdır. Bu prosedürün en zor kısmı, iğneyi hücrelere kadar kırılmadan indirmektir.

Başarıyı sağlamak için, odak düzlemleri boyunca ilerletirken iğneyi görselleştirmek amacıyla normalde hizalama için kullanılan bir Bertrand lensi kullanıyoruz. Mikroskop bir mikro enjektöre bağlanmış olmalı ve verileri toplamak ve depolamak için yeterli belleğe sahip bir bilgisayar tarafından kontrol edilmelidir; mikroskobu ve mikro enjektörü açın ve sahnenin ısınmasını beklerken ısıtmalı sahnenin 37 °C'ye ulaşması için zaman tanıyın. Hücreleri 37 °C'de 30 dakika boyunca boya ile etiketleyin.

Analize bağlı olarak etiketleme; bir mililitre HBSS içerisinde beş mikrolitre, dört veya 2:00 AM ile veya bir mililitre tam besiyeri içerisinde iki mikrolitre kalsiyum am ile yapılabilir; burada dört veya iki kullanılır. Hücre besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve yerine iki milimolar kalsiyum klorür takviyeli bir mililitre RPMI ekleyin.

Kabı mikroskoba yerleştirin, parlak alanla hücreleri netleyin ve ardından odak noktasını hücrelerin biraz üzerine ayarlayın. Sonra, bir mikrolitre SLO toksini, dört mikrolitre 10 mg/mL DEXTRA 5 55 ve altı mikrolitre suyu karıştırın. Ardından, 4 °C'de 10 dakika boyunca 20,000 ×g ile santrifüjleyin.

Dekstran, femto ucun tıkalı olmadığını doğrulamak için kullanılır. Bir mikro yükleyici kullanarak, seyreltilmiş toksinden iki mikrolitreyi femto ucun arka kısmından yükleyin. Femto ucu mikro enjektöre yerleştirin.

Ardından, enjektör ucunun hücrelerin merkezinin üzerinde duracağı ve her yöne hareket edebileceği şekilde enjektör açısını ayarlayın; mikro enjektör ucunun ne kadar aşağı inebileceğini sınırlayan önceki Z limiti ayarlarını temizleyin. Mikro enjektörü, 20 PSI geri basınçla 120 PSI'da 0,5 saniye boyunca enjeksiyon yapacak şekilde ayarlayın. Daha sonra, uç besiyerine girene kadar aşağı indirin.

Bertrand lensi kullanarak ucu ortalayın ve uç hücrelere doğru indirilirken onu takip edin. İğne odak dışına çıktığında, normal optiklere geri dönün.

İğnenin gölgesi görüş alanında belirgin olmalıdır. Hücrelerin üzerini odaklayın ve iğne netleşene kadar iğneyi indirin. Ardından hücreleri odaklayın ve iğneyi dikkatlice bir hücrenin yanına getirin.

Enjeksiyon için Z limiti ayarlandıktan sonra görüntülemeye başlayın ve toksini enjekte edin. Ardından iğneyi yukarı kaldırın ve hücrelerin yeni bir bölgesine geçin. Ek toksin enjekte edin ve enjeksiyon sonrası görüntülemeye devam edin.

İğneden istenmeyen herhangi bir toksin sızıntısını önlemek için iğneyi, bu videoda açıklanan yöntemi kullanarak ev konumuna getirin, mililitre başına 10⁷ ila 10⁸ birim. SLO tipik olarak 4 mg/mL protein konsantrasyonu ile elde edilir. Bu SDS-PAGE jeli, toksin indüksiyonu öncesi ve sonrası bakteriyel örnekleri ile saflaştırmayı takip eden üç elüasyonun her birini göstermektedir; Coomassie blue boyama, indüklenen SLO'nun başarıyla saflaştırıldığını ortaya koymaktadır.

T 27 A veya D iki hücrelerinin lizi için gerekli toksin miktarını belirlemek amacıyla, 69 kilodaltondaki bant SLO olarak tanımlanmıştır. Hücreler, propidyum iyodür varlığında 37 °C'de beş dakika boyunca çeşitli SLO konsantrasyonlarına maruz bırakılmış ve akış sitometrisi ile incelenmiştir. Spesifik liz, burada gösterildiği şekilde belirlenmiştir.

Mililitre başına 250 ünite. SLO, hem T 27 A hem de D iki hücrelerinin %50 lizisini sağlar. Toksinin sublitik %10 lizis dozu mililitre başına 62.5 ünite olacaktır.

Bu değerler, toksin maruziyeti sonrası hücre ölümünü değerlendirmek için referans toksin aktivitesi açısından önemlidir. İnsan dermal fibroblastları, Life Technologies marka bir canlı-ölü kiti kullanılarak kalsiyum ve atherium homodimeri ile inkübe edildi. Bakteriyel toksin anthro lysin O'ya lokalize maruziyetin ardından, bu görüntüde kalsiyum yeşil ve atherium bromür kırmızı renkte gösterilmiştir; mikrobiyomun yakınındaki bölgeler kalsiyum kaybı ve athe homodimer alımı ile karakterize edilen hücre ölümünü gösterirken, uçtan daha uzak bölgeler herhangi bir hasar göstermeyecektir.

Toksinin mikro düzeyde iletilmesi, kalsiyum akışı gibi gerçek zamanlı olayların incelenmesine de olanak tanır. 4:02 AM ile yüklenen bu insan dcs'leri, yeşilden maviye geçişin eş zamanlı canlı görüntülemesiyle birlikte, sabit bir akış hızında SLO'ya maruz bırakılmıştır. Sözde renk, sitozolik kalsiyum seviyelerindeki artışı belirtmektedir.

SLO, lokalize uygulama nedeniyle kabın bölgesinde yayılan hızlı bir sitozolik kalsiyum artışını tetikler. Ancak, yalnızca mikro enjektör ucuna yakın hücreler toksine maruz kalır ve tepki verir. Bu durum, hem toksine verilen tek hücreli tepkiyi hem de z eksenindeki olayları çözümlemek için toksin uygulamasının mekansal olarak kısıtlanmış alanını kanıtlamaktadır.

Mikro iletim, yüksek hızlı 3D konfokal mikroskopi ile birleştirilmiştir. Bu görüntü seti, toksin enjeksiyonu sonrası dendritik hücreleri göstermektedir. Plazma membranını işaretlemek için, yeşil renkte gösterilen bir PC'ye konjuge edilmiş anti CD 11 C ile önkuluvasyon yapılmıştır.

Burada görülebileceği üzere, toksin iletimini takiben mikrovesiküller salınır. Hücresel onarım sürecinin bir parçası olarak, toksin molekülleri, toksini uzaklaştırmak için kopan blebler üzerinde yoğunlaşır. Yöntem kavrandıktan sonra, mikroskopi işlemi 45 dakikada tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, hücrelerle karıştırmadan önce toksini soğuk tutmayı ve hemolitik aktiviteyi test etmeyi hatırlamak önemlidir. Güzel. Bu videoyu izledikten sonra, canlı hücre mikroskobisi kullanarak bakteriyel toksinlere karşı bağışıklık hücresi yanıtlarının gerçek zamanlı kinetiğinin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.