Tek iplikli DNA, çift iplikli DNA ve RNA Hidroksiapatit Kromatografisi kullanarak bir Çevre Viral Topluluk ayrılması

Bu video, karışık viral toplulukların nükleik asit bileşimlerine göre ayrılmasına yönelik bir prosedürü göstermektedir. Bu yöntem, karmaşık viral toplulukların taksonomik çeşitliliğinin ve fonksiyonel potansiyelinin incelenmesine olanak tanır. Burada nükleik asitlerin ayrılmasında kalsiyum fosfatın kristal bir formu olan hidroksiapatit kullanılmaktadır.

Öncelikle, bir Hidroksiapatit kolonu doldurulur ve dengelenir; ardından saflaştırılmış viral nükleik asitler kolona uygulanır. Hidroksiapatitin pozitif yüklü kalsiyum iyonları ile nükleik asit alt tiplerinin negatif yüklü fosfat omurgası arasındaki yük etkileşimi, nükleik asitlerin kolona bağlanmasını sağlar. Daha sonra, tek sarmallı DNA/RNA ve çift sarmallı DNA, farklı konsantrasyonlardaki fosfat tamponları ile sırayla elüe edilir. Elde edilen nükleik asitler, görselleştirme, miktar belirleme ve DNA dizileme yoluyla tanımlama hazırlığı amacıyla tuzdan arındırılır ve konsantre edilir; agaroz jel elektroforezi, nükleik asit türlerinin %9'dan daha az taşıma (carryover) ile ayrılabileceğini doğrular.

Böylece bu yöntem, viral toplulukların çeşitliliğinin ve fonksiyonel kapasitesinin değerlendirilmesine olanak sağlar. Merhaba, ben Doug Fro; j Craig Venture Enstitüsü'nde Dr. Shannon Williamson'ın laboratuvarında araştırma görevlisiyim. Bugün size çevresel bir viral topluluktan tek zincirli DNA, çift zincirli DNA ve RNA'yı ayırma prosedürünü göstereceğim.

Bu yöntemin, DNA veya RNA'yı hedefleyen çekirdek ile tedavi gibi mevcut yöntemlere göre avantajları vardır. Hidroksiapatit kromatografisi, tüm viral topluluğu yakalama kapasitesine sahiptir. Bu yöntem, viral ekoloji alanındaki birçok soruyu yanıtlamamıza olanak tanır.

Örneğin, toplam gen tamamlayıcılığı veya viral topluluğun çeşitliliği nedir? Genetik imzanın bir alt kümesinden ödün vermeden Chesapeake Körfezi'ndeki tüm Rio Plankton topluluklarını incelemek istediğimizde ilk olarak bu yöntemi düşündük. Bu deney için gerekli çözeltiler, beraberindeki yazılı protokoldeki talimatlara göre önceden hazırlanmalıdır; bunlar 0,12 molar fosfat tamponu, 0,20 molar fosfat tamponu, 0,40 molar fosfat tamponu ve bir molar fosfat çözeltisini içerir.

Deney günü, tamamı pH 6.8 olan tüm fosfat tamponlarını ve hidrate hidroksiapatiti 60 derece Celsius sıcaklıktaki bir su banyosuna yerleştirerek dengeleyin. Bu prosedüre, viral nükleik asitlerin ayrıştırılması için kullanılacak econo kolonu hazırlayarak başlayın. Econo kolonun ucuna bir musluk takın ve kapalı olduğundan emin olun.

Bir pipet yardımıyla kolona deiyonize su ekleyin, ardından kolonun üzerine kapağı kapatın ve durulamak için kolonu defalarca altüst edin. Suyu dökün ve bu yıkama işlemini birkaç kez tekrarlayın. Daha sonra, econ kolonundan stop musluğunu çıkarın ve sterilize etmek için otoklavlayın.

Stop kok eriyeceği için otoklavlanmaz. Stop koku önce iyonize suyla, ardından %70 etanol ile durulayın ve otoklavlamadan sonra havada kurumaya bırakın. Stop koku yerine yerleştirin ve kapatın.

Ardından, çeker ocak altında çalışarak, kolona bir mililitre sigma coat ekleyin ve kolonu burada gösterildiği gibi döndürerek ters çevirip kolon camını kaplayın. Sigma coat ile kaplama işlemi, nükleik asitlerin cam yüzeye yapışmasını minimize edecektir. Ayırma işlemi sırasında, bir tuz cam yüzeyi kaplanmış olur.

Musluğu açın ve içeriği konik bir tüpe boşaltın. Ardından, kolonu sirkülasyonlu bir su banyosuna bağlamak için, kolonu bir ring standa sabitlemek üzere iki adet kıskaç kullanın. Sirkülasyonlu su banyosundan gelen silikon hortumları, suyun akış yönü aşağıdan yukarıya olacak şekilde bağlayın.

Sıcaklığı 60 °C'ye ayarlayın ve sirkülasyonu başlatın. Uygulamada, kolon ve borular alüminyum folyo veya köpük boru izolasyonu gibi bir yalıtım malzemesiyle sarılmalıdır. Isı kaybını en aza indirmek için bu adım burada gösterilmemiştir.

Prosedürü daha iyi gözlemleyebilmek için musluğu kapatın. Bir pipet yardımıyla 10 mililitre steril RNAz içermeyen su ekleyin. Musluğu açın ve suyun boşalmasını sağlayın.

Ardından, ikinci yıkama işlemini takip ederek tekrar yıkayın. 10 mililitre steril RNA'sız 0,12 molar fosfat tamponu ile iki kez durulayın ve yıkamalar arasında sıvıyı dökün. Kolon artık hidroksiapatit kromatografisi için hazırdır.

Ekonomi kolon musluğunun kapalı olduğundan emin olun. Ardından, steril iki mililitrelik serolojik bir pipet kullanarak, hazırlanan resüspande rehidrate hidroksiapatitten iki mililitreyi yavaşça kolonun tabanına ekleyin. Kolon kapağını yerine takın.

Hidroksiapatitin yerçekimi etkisiyle çökelmesi için 30 dakika bekleyin. Bu yöntem, ayrıntılara dikkat edilmesini gerektirir. Hidroksiapatit kolonu dakikada 0,25 ile 0,5 ml arasında bir hızla işlem görür.

Bu nedenle, kolonun kurumasını önlemek için kolonu yakından takip etmek çok önemlidir. 30 dakika geçtikten sonra, tamponu bir atık kabına boşaltmak için musluğu açın. Ardından musluğu kapatın ve akışta kalan sıvıyı (flow-through) atın.

Nükleik asitleri, toplam 500 µL hacme ulaşacak şekilde 0,12 molar fosfat tamponu ile birleştirin ve 60 °C'de 10 dakika boyunca inkube edin. Bu işlem, nükleik asitlerin kolon sıcaklığıyla dengelenmesini sağlayacak ve mevcut olabilecek ikincil yapıları ortadan kaldırarak farklı nükleik asit türlerinin ayrılmasını kolaylaştıracaktır. İki mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, kolonu sarsmamaya dikkat ederek nükleik asit çözeltisini hızlıca hidroksiapatit üzerine uygulayın.

500 µL'nin tamamı kolona aktığında, kolonun kurumasını önlemek için kolonun üst kısmına az miktarda 0,12 M fosfat tamponu eklenebilir. Nükleik asitlerin hidroksiapatite bağlanması için 30 dakika bekleyin. Bağlanma inkübasyonunun ardından, kolonun altına 15 mL'lik konik bir tüp yerleştirin.

Ardından musluğu açın ve tek zincirli DNA içeren ilk 500 µL örneği toplayın. 500 µL toplandıktan sonra musluğu kapatın. Daha sonra, kolonu sarsmamaya dikkat ederek, hidroksiapatite altı mililitre 0,12 molar fosfat tamponu ekleyin.

Ardından musluğu açın ve tek zincirli DNA içeren akışın önceden kullanılan aynı 15 mililitrelik tüpe toplanmasına devam edin. Yaklaşık altı mililitre toplandıktan sonra musluğu kapatın. Tüpe bir hacim fenol kloroform izoamil alkol solüsyonu ekleyin, vortex ile güçlü bir şekilde karıştırın ve ardından 15 dakika boyunca 3.500 ×g'de santrifüjleyin.

Santrifüj işleminin ardından tüpte iki tabaka oluşacaktır. Tek zincirli DNA'yı içeren üstteki sulu tabakayı yeni bir 15 mililitrelik tüpe aktarın ve örneği oda sıcaklığında saklayın. RNA'yı kolondan elue etmek ve saflaştırmak için altı mililitre 0,20 molar fosfat tamponu ekleyin ve yeni bir 15 mililitrelik tüp kullanmadan önce akış sıvılarını toplayın. Ardından fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirin.

Tek sarmallı DNA örneği için, kolondan çift sarmallı DNA'yı elüye etmek ve saflaştırmak amacıyla altı mililitre 0,40 molar fosfat tamponu kullanarak bu işlemi tekrarlayın. Son olarak, kolondaki tüm kalıntı çift sarmallı DNA'yı temizlemek için bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.

Bu sefer nükleik asit örneklerini tuzdan arındırmak için altı mililitre 1.00 molar fosfat tamponu kullanın. Her bir örneğin dört ila beş mililitresini, 30.000 moleküler ağırlık kesim limitli ultra hücre membranına sahip bir Ultra four santrifüj filtre cihazına aktarın; sabit açılı bir rotorda, 30 °C'de 6.000 g'de yaklaşık beş dakika döndürerek örneği 500 µL'den daha az hacme konsantre edin. Süzüntüyü döktükten sonra, örneklerin geri kalanını filtreye ekleyin.

Hacmi, RNA içermeyen 1X TE tamponu ile dört ila beş mililitreye tamamlayın. Ardından, konsantre bir hacim elde edilene kadar tekrar santrifüjleyin. Santrifüjden yaklaşık beş dakika sonra, filtreye ve konsantreye dört ila beş mililitre RNA içermeyen 1X TE tamponu ekleyin.

Nükleik asit örneklerini tamamen tuzdan arındırmak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Örnekler tamamen konsantre edilip tuzdan arındırıldıktan sonra, kalan nükleik asit örneklerini steril 1,7 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hacmin onda biri kadar sodyum asetat, iki hacim %100 etanol ve bir mikrolitre glyco blue ekleyip vorteksle iyice karıştırdıktan sonra santrifüjleyerek nükleik asitleri çöktürün.

4 °C'de 28.000 g'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Pelletin rahatmamasına dikkat edin.

300 µL %70 etanol ekleyin, oda sıcaklığında 28.000 ×g'de 10 dakika santrifüj edin, kurutun ve her fraksiyonu uygun hacimdeki RNAz serbest TE tamponunda yeniden süspanse edin. Viral nükleik asitlerin eşit konsantrasyonları; M13 MP18 tek zincirli DNA, MS2 tek zincirli RNA, F16 çift zincirli RNA ve lambda çift zincirli DNA birleştirilmiş, ardından bu videoda gösterildiği gibi hidroksiapatit kromatografisi kullanılarak ayrılmıştır. Eyal konsantrasyonlardaki M13 MP18 tek zincirli DNA, MS2 tek zincirli RNA, F16 çift zincirli RNA ve lambda çift zincirli DNA, şerit 6'da gösterildiği gibi birleştirilmiş ve burada görülebileceği üzere bir hidroksiapatit kolonuna uygulanmıştır.

Tek sarmallı DNA-RNA ve çift sarmallı DNA, 0,12 molar, 0,18 molar, 0,40 molar ve 1,00 molar fosfat tamponu kullanılarak Hidroksiapatit kolonundan bağımsız olarak elüe edildi. Genom boyutlarını doğrulamak için 1 KB ladder kullanıldı. Bu sonuçlar, bu yöntemin tek sarmallı DNA, çift sarmallı DNA ve RNA'yı, bir fraksiyondan diğerine %9'dan daha az taşınma ile başarıyla ayırmak için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu yöntem, burada gösterildiği gibi Chesapeake Bay'deki bir viral topluluğundan izole edilen nükleik asitlerin ayrıştırılması için de kullanılmıştır. Tek zincirli DNA/RNA ve çift zincirli DNA, sırasıyla 0,12 molar, 0,20 molar ve 0,40 molar veya 1,00 molar fosfat tampon konsantrasyonları kullanılarak bağımsız olarak elüe edilmiştir; birinci şeritte yüksek kütleli DNA merdiveni ve ikinci şeritte 1 KB merdiveni, nükleik asitlerin yaklaşık moleküler ağırlığını ve kütlesini görsel olarak doğrulamak için kullanılmıştır. Burada görülebileceği üzere, çift zincirli DNA, Chesapeake Bay virio planktonundan ekstrakte edilen baskın nükleik asit tipidir. Bu videoyu izledikten sonra, hidroksiapatit kromatografisi kullanarak karışık bir viral topluluğundan nükleik asitlerin nasıl ayrıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu işlem; Hidroksiapatit kolonunun ve nükleik asitlerin hazırlanmasını, çeşitli konsantrasyonlardaki fosfat tamponu ve tuz giderme işlemi kullanılarak nükleik asitlerin ayrılmasını ve elüsyonunu ve ayrıştırma sonrası nükleik asitlerin konsantre edilmesini içerir.