DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü
9 Ocak 2013
Sivrisinek örneklerden kalitesi sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için bir hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklanmıştır. Basit bir yöntem sivrisinek orta bağırsak ve tükürük bezi aşamalarında sıtma parazitlerinin genotipleme yanı sıra moleküler tanımlanması, Chelex reçine çelatlama özelliklerine etkinleştirir sermaye Anofel PCR ile türlerin kardeş.
Bu prosedürün genel amacı, anomali gösteren örneklerin orta bağırsak ve tükürük bezi bölümlerinden sıtma, parazit ve sivrisinek DNA'sı ekstre etmektir. Bu işlem, öncelikle sivrisineğin karın ve göğüs arasındaki eklemden tam olarak kesilerek orta bağsızın tükürük bezi bölümünden ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, her bir bölüm deiyonize su içinde ayrı ayrı öğütülür.
Ardından doku süspansiyonuna lye işlemi uygulanıp yıkanır ve hücre peleti geri kazanılır. Son olarak, hücre peleti yeniden süspande edilip kaynatılır ve DNA ekstre edilir. Nihayetinde, PCR ve alele özgü restriksiyun enzimi sindirimi yoluyla anomalilerin, vektör türlerinin ve malarya enfeksiyonlarının genotiplerinin belirlenmesinde kalıp olarak kullanılmaya uygun, yüksek kaliteli sivrisinek ve malarya paraziti DNA'sı gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu oldukça basit tekniğin, organik ekstraksiyon ve ayıklama yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok az miktarda güvenli ve kolayca temin edilebilen reaktifler kullanması ve işlem süresinin çok daha kısa olmasıdır. Sivrisineği diseke etmeye başlamak için, onu küçük bir paraform parçası üzerine yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobuna monte edin. Üzerini bir damla deiyonize su ile kaplayın.
Dokuyu yumuşatmak için, sivrisinek gövdesini toraks ile abdomen arasındaki eklem noktasından tam olarak kesin. Böylece baş ve toraks kısımlarını abdomen bölümünden ayırmış olursunuz. Diseke edilen her bir sivrisinek bölümünü, sivrisinek kimlik numarası ve vücut bölümü ile önceden etiketlenmiş, temiz otoklavlı 1,5 milliliter mikrosantrifüj tüpüne aktarın; parafilmi atın ve bir sonraki sivrisineğe geçmeden önce mikroskop tablasını %70 alkol ile nemlendirilmiş bir Kim wipe ile dikkatlice silin. Sivrisinek DNA'sını ekstrakte etmek için, öncelikle numune tüpüne 20 microliters deiyonize su pipetleyin.
Ardından, daldırılmış sivrisinek kesitini homojen bir süspansiyon haline getirmek için pipet ucunu kullanarak ezin. Örnek homojenatına 100 µL otoklavlanmış 1% saponin içeren XPBS çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vorteksleyin. Örneği oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
Ardından 20,000 G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Peleti 100 µL 1X PBS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra santrifüj işlemini tekrarlayın.
75 µL steril deiyonize su ve deiyonize su içinde %20 ağırlık/hacim oranında Cellex 100 reçine süspansiyonundan 25 µL ekleyin ve bunsen beki ile sterilize edilmiş 23 gauge hipodermik iğne kullanarak pellet'i yeniden süspand etmek için nazikçe vorteksleyin. Örnek tüpünün kapağına bir delik açın.
Örnek süspansiyonunu bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca kaynatın. 20,000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve DNA çözeltisini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini kontrol etmek için PCR reaksiyonlarında kalıp olarak kullanılmak üzere önceden etiketlenmiş bir saklama tüpüne aktarın; burada, eklem bacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz alt birim dört geninin 400 baz çiftlik bir fragman üretmesi beklenen bölgesini amplifiye edin. Ardından, Ananais Gambia türlerini ayırt etmek için, Ananais Gambia Sens Stricto için 390 baz çifti ve Ananais api için 315 baz çifti boyutlarında ürünler üretmesi beklenen intergenik ara bölgedeki SNP'leri çevreleyen bir bölgeyi amplifiye edin.
Ardından, p. falciparum antifolat ilaç direnci polimorfizmlerinin genotiplemesi yapılır. 16, 51, 59, 108 ve 164 numaralı amino asit kodonlarını çevreleyen bölgeyi çoğaltmak için nested PCR uygulanır. Parazitlerin dihidrofolat redüktaz genindeki amplikonun, antifolat ilaç direncini tespit etmek için alele özgü sindirimi gerçekleştirilir.
İlişkili polimorfizmler. Reaksiyonları %2 AROS jel elektroforezi ile kontrol edin. Sivrisinek DNA ekstrakt kalitesi analizi, RABIS moleküler tanımlama ve p. falciparum genotiplemesi için yapılan PCR analizlerinden elde edilen sonuçlar, basitleştirilmiş Kelex yönteminin daha az adım ve standart tuz çöktürme protokolünün dörtte birinden daha kısa sürede, ilgili ekstraktlarda benzer DNA kalitesiyle benzer sonuçlar verdiğini göstermektedir; anomaliler, Gambiya kardeş türleri ve parazit enfeksiyon oranları açısından örnek pozitiflik oranlarının McNear ki-kare testine göre istatistiksel olarak farklı çıkmaması şaşırtıcı değildir.
Hem basitleştirilmiş kelex hem de standart tuz çöktürme protokolü için PCR inhibitörlerinin uzaklaştırılması nedeniyle, reaksiyon karışımlarına BSA eklenmesi PCR pozitifliklerinde genel bir artışla sonuçlanmıştır. Ancak, kelex ekstraktlarındaki DNA kalitesi hariç, bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. p falciparum amplikonunun alele özgü restriksiyon enzimi ile sindirimi, yöntem uzmanlaşıldıktan sonra orta bağırsak ve tükürük bezi sıtma enfeksiyonlarının ilaç direnç allelleri için genotiplendirilmesine olanak tanır.
Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında yaklaşık 37 dakikada tamamlanabilmelidir.
Genel Bakış
Bu makale, sıtma parazitleri ve sivrisinek vektörlerinden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemi tanımlamaktadır. Chelex reçine kullanımıya dayanan bu teknik, sıtma parazitlerinin etkili bir şekilde genotiplemesine ve Anopheles türlerinin moleküler tanımlanmasına olanak sağlar.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Genomik
Arka Plan
- Sıtma, Anopheles sivrisinekleri tarafından bulaştırılan ciddi bir küresel sağlık sorunudur.
- Geleneksel DNA ekstraksiyon yöntemleri zaman alıcı olabilir ve tehlikeli reaktifler gerektirebilir.
- DNA ekstraksiyonu için daha basit, daha güvenli ve daha verimli tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır.
- Bu çalışma, Chelex reçinesi kullanarak bu ihtiyaçları karşılayan bir yöntemi tanıtmaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Sıtma parazitleri ve sivrisinek vektörlerinden DNA ekstraksiyonu için hızlı ve maliyet etkin bir yöntem geliştirmek.
- Sıtma parazitlerinin genotiplendirilmesini ve Anopheles türlerinin tanımlanmasını sağlamak.
- Yeni yöntemin verimliliğini ve etkinliğini geleneksel protokollerle karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sivrisinek örneklerinin orta bağırsak ve tükürük bezi bölümlerini ayırmak için diseksiyonu.
- Bir süspansiyon oluşturmak için dokunun deiyonize su içerisinde öğütülmesi.
- DNA ekstraksiyonu için Chelex reçine kullanımı.
- Genotiplendirme ve tür tanımlama için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR).
Ana Sonuçlar
- Chelex yöntemi, PCR için uygun yüksek kaliteli DNA sağlar.
- Sonuçlar, işlem süresinin önemli ölçüde azaldığı geleneksel yöntemlerle karşılaştırılabilir düzeydedir.
- Tür tanımlama ve parazit enfeksiyonları için örnek pozitiflik oranları, yöntemler arasında istatistiksel olarak benzerdi.
- BSA eklenmesi, inhibitörleri azaltarak PCR sonuçlarını iyileştirmiştir.
Sonuçlar
- Basitleştirilmiş Chelex yöntemi, sıtma vektörlerinden DNA ekstraksiyonu için etkilidir.
- Bu teknik 40 dakikanın altında tamamlanabildiği için rutin kullanım için pratiktir.
- Geleneksel DNA ekstraksiyon yöntemlerine göre daha güvenli ve daha verimli bir alternatif sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda, sıtma vektörlerinin ve parazitlerinin sürdürülebilir moleküler sürveyansı, performans ile operasyonel basitliği dengeleyen DNA ekstraksiyon yöntemlerini gerektirir. Chelex tabanlı protokol, reaktif karmaşıklığını azaltırken ve işlem süresini yaklaşık üç saatten 40 dakikanın altına indirirken, yerleşmiş tuzlama (salting-out) yöntemleriyle kıyaslanabilir DNA kalitesi sunar. Bu durum, yöntemi endemik bölge araştırmaları ve kontrol programlarında ölçeklenebilir, maliyet etkin genotipleme ve tür tanımlama iş akışlarını mümkün kılan pratik bir araç haline getirir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tür konfirmasyonu ve enfeksiyon durumunun değerlendirilmesi için DNA şablonları sağlayarak vektör-parazit etkileşimlerinin incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Uygulama süresini ve reaktif yükünü azaltarak, sahada toplanan örneklerin işlenmesinde daha yüksek verimliliği destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Vektör türlerinin ayırt edilmesini ve parazit genotiplemesini hedefleyen PCR tabanlı analizler için uygun DNA üretir.
- Operasyonel Değer: Sadece üç reaktif (deiyonize su, saponin, Chelex reçinesi) kullanarak analiz standardizasyonunu artırır ve kaynakların kısıtlı olduğu laboratuvarlarda değişkenliği azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Vektör koleksiyonundan, nested PCR ve restriksiyon sindirimi yoluyla ilaç direnci genotipleme gibi alt uygulamalara kadar olan sürecin sürekliliğini destekler.
- Operasyonel Değer: Tehlikeli organik çözücü kullanımını ortadan kaldırarak saha laboratuvarlarında güvenliği ve erişilebilirliği artırır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, numune işlemeden genetik analize kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur; PCR tabanlı tanımlama ve genotipleme analizleri için güvenilir girdi sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Saha ortamlarında vektör tür dağılımı ve Plasmodium falciparum enfeksiyon oranlarına ilişkin hipotezlerin test edilmesini kolaylaştırır.
- Tarama: Multiplex PCR uygulamaları için yeterli kalite ve verimde DNA ekstratları sağlayarak analiz hazırlığını destekler.
- Analitik: ND4, türe özgü SNP'ler ve ilaç direnci lokuslarının PCR amplifikasyonu aracılığıyla kantitatif değerlendirmeye olanak tanıyarak örnek grupları arasında karşılaştırma yapılmasını sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Entomolojik sürveyansı parazit genotiplemesi ile ilişkilendirerek sıtma kontrol stratejilerinde riske göre ayarlanmış kararları destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Protokolün basitliği ve minimum ekipman gereksinimi (mikrosantrifüj, ısıtma bloğu), birden fazla saha alanı ve araştırma ekibi tarafından benimsenmesine olanak tanır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kıyaslama yöntemleriyle karşılaştırılabilir hassasiyet ve özgünlük sağlayarak, vektör türlerinin tanımlanmasında ve parazit tespitinde öngörücü güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Minimum reaktif bağımlılığı ile yüksek tekrarlanabilirlik elde ederek, uzak bölgelerdeki tedarik zinciri hassasiyetini azaltır.
- Stratejik Değer: Moleküler onay için sonuç alma süresini kısaltarak, sürveyans programlarında daha hızlı karar verme süreçlerini mümkün kılar.
- Portföy Etkisi: Vektör yetkinliği ve parazit yaygınlığı hakkında zamanında ve doğru veriler sunarak, müdahalelerin riskle uyumlu önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Doku diseksiyonu, homojenizasyon ve PCR kurulumu için temel moleküler biyoloji eğitimi gereklidir.
- 20,000 × g kapasiteli bir mikrosantrifüje ve kaynatma adımı için bir ısıtma bloğuna erişim gereklidir.
- Ekipler arası standardizasyon, homojenizasyon ve reçine resüspansiyonu sırasında tutarlı vorteksleme ve pipetleme tekniklerinden fayda sağlar.
- Diğer sivrisinek türlerine veya örnek tiplerine adaptasyon, lizis verimliliğinin ve inhibitör gideriminin doğrulanmasını gerektirebilir.
- Pratik sınırlama: Yöntem, modifikasyon yapılmadığı takdirde ultra yüksek kapasiteli otomasyonu sınırlayabilecek manuel bir öğütme adımı içermektedir.
