FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

Bu prosedürün genel amacı, geçici reseptör potansiyeli veya TRPA1 kanalının farmakolojik profilini incelemek için Flex Station three uygulamasını göstermektir. Bu, öncelikle 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında TRPA1 kanallarını eksprese eden hücrelerin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.

Hücreler bir mikroplaka yıkayıcıda yıkandıktan sonra, kalsiyuma duyarlı floresan boya ile yüklenir. Hücre yükleme süresinin ardından birkaç ek yıkama işlemi gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, bir TRIP-1 agonisti ve olası bir TRIP-1 antagonistini içeren bileşik plakasını hazırlamaktır.

Son adım olarak, Flex Station three sisteminde plaka okuma için yazılım parametreleri ayarlanır. Nihayetinde, flu phonemic acid ile trip A one aktivasyonu ve antagonist bileşik A ile inhibisyonu için doz yanıt ilişkilerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Bu yöntem, kalsiyum girişini ölçerek 21 aktivasyon mekanizmaları hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, kalsiyuma duyarlı frozen boyalar veya maly potansiyel boyalar kullanılarak diğer kalsiyum geçirgen eye kanallarının ve deep protein coupled reseptörlerinin fonksiyonlarını incelemek için de uygulanabilir.

Bu Taktiğin, kalsiyum görüntüleme ve manuel yama haritalama gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu zaman tasarrufu sağlayan tekniğin kalsiyum formülü, demir kanalları ve diğer ca mobilize edici reseptörlerin fonksiyonu ve modülasyonu için yüksek kapasiteli tarama sağlamasıdır. Bu protokole başlamadan önce, yazılı protokolde açıklandığı üzere, trip A one ile stabil olarak transfekte edilmiş HEC 2 93 hücrelerini %70 ila %90 yoğunluğa ulaşana kadar büyütün. Kalsiyum deneyi için hücre hazırlığına başlamak üzere, her bir kuyucuğa 50 µL poli-L-ornitin pipetleyerek 96 kuyucuklu plakaları kaplayın ve plakaları 37 °C'de en az 15 dakika inkübe edin.

İnkübasyonun ardından hücreleri bir kez KO'nun fosfat tamponlu salini ile yıkayın. Tripsin işleminden sonra, HEC 2 93 hücrelerinden istenen miktarı 15 mililitrelik steril konik tabanlı bir tüpe aktarın ve örneği santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın ve oluşan hücre peletini yeniden süspande edin.

%10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovine serum ile takviye edilmiş DMEM kültür ortamı içerisinde, 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 100 µL hücre süspansiyonu dağıtın. Çok kanallı pipet kullanarak, plakayı nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörüne 20 ila 44 saat süreyle yerleştirmeden önce, steril kabin içerisinde en az 30 dakika bekletin. Kalsiyum analizi hazırlığı için öncelikle yazılı protokolde açıklandığı şekilde çözeltileri hazırlayın.

Hazırlandıktan sonra, 1 mM flu oh 4:00 AM'den 10 µL ile onic. F1 27'den 10 µL karıştırın, tüm içeriği %0,1 sığır serum albumin eklenmiş 5 mL flu. oh dört analiz tamponuna aktarın.

Ardından, 96 kuyucuklu plakalarda büyütülen hücreleri, bir mikroplaka yıkama cihazı kullanarak kuyucuk başına 80 µL HBSS ile iki kez yıkayın. Yıkama işleminin ardından, çok kanallı bir pipet yardımıyla kuyucuk başına 50 µL Fluo-4 yükleme çözeltisi ekleyin ve plakayı 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bir saatlik hücre yükleme süresi boyunca, agonistlerin üç katı (3x) konsantrasyonundaki çözeltilerinden oluşan bir seri, antagonistlerin üç katı (3x) konsantrasyonundaki çözeltilerinden oluşan bir seri ve Fluo-4 analiz tamponu içerisinde 300 µM agonist içeren yüksek hacimli bir stok hazırlayın.

Seyreltilmiş bileşik çözeltilerinden 300 µL'yi 96 kuyucuklu bir bileşik plakasına aktarın. Mümkün olduğunca, bir bileşiğin seri seyreltmesi ile buna karşılık gelen pozitif ve negatif kontrollerin bileşik plakasının aynı sütununda yer almasını sağlayın. Flex station three her seferinde tek bir sütun okuduğundan, son hücre hazırlama adımı olarak, antagonist içeren her kuyucuğun yanına 300 µM agonist çözeltisinden 300 µL pipetleyin.

Yüklü hücreleri, mikroplaka yıkayıcıyı kullanarak flu oh four asit tamponu ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra her kuyucukta 80 µL flu oh four asit tamponu bırakın. Plaka okumaya başlamak için Flex Station three sistemini açın ve soft max Pro 5.2 yazılımını çalıştırın.

Deneyi kurulum aşamasında yeni bir dosya adıyla kaydedin. Flex modu seçin ve yazılı prosedürde listelendiği üzere agonist ve antagonist etkilerini ölçmek için parametreleri girin. Ardından, yeni bir uç kutusunu, bileşik plakasını ve okuma plakasını flex istasyonunun uygun tepsilerine yerleştirin. Üç.

Soft Max Pro yazılımındaki okuma düğmesine tıklayarak plaka okuma işlemini başlatın. Flex Station three, her seferinde bir sütunu okuyacak ve okumayı kesintiye uğratmadan önceden programlanmış zaman noktalarında bileşikleri ekleyecektir. Çalışma tamamlandığında, deneysel veriler doğrudan Soft Max PRO yazılımı kullanılarak işlenebilir veya Microsoft Excel gibi herhangi bir hesap tablosu programına kopyalanıp yapıştırılabilir.

Verileri analiz etmek için, yazılı prosedürde açıklandığı üzere en küçük kareler uydurma yöntemini kullanarak TRPA1 agonisti olan fluphenamic acid ve putative TRPA1 antagonisti olan bileşik A için konsantrasyon yanıt eğrileri oluşturun. TRPA1, aktivasyonu kalsiyuma duyarlı boya Fluo-4AM ile tespit edilebilen kalsiyum girişine yol açan, kalsiyum geçirgen bir katyon kanalıdır. Bir dizi fluphenamic acid veya FFA konsantrasyonuna yanıt olarak floresan değişimlerinin zaman seyirlerine ait temsili izler, yüksek konsantrasyonlarda gösterilmiştir. Benzer pik floresan seviyelerine rağmen, FFA tarafından tetiklenen floresan artışı, düşük konsantrasyonlara göre çok daha hızlı bir kinetik sergiler.

Bu farkları ayırt etmek için, floresans artışının başlangıç hızları ölçülerek konsantrasyon yanıt ilişkisi oluşturulmuştur. Farklı FFA konsantrasyonlarının eklenmesiyle, FFA'nın yarı maksimal etkili konsantrasyonu 55.4 micromolar olarak belirlenmiştir. Muhtemel bir trip a one antagonisti olan bileşik A tarafından FFA kaynaklı kalsiyum yanıtının inhibisyonuna dair konsantrasyon yanıt ilişkisi de gösterilmiştir.

Bir doz, trip A one hücrelerinin FFA'ya verdiği yanıtı 4,3 micromolar yarı maksimal inhibitör konsantrasyonu ile bağımsız olarak azaltmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, flag station three kullanarak triple A one ve ilgili kanalların farmakolojik profillerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.