HO-Endonuclease Oluşum kantitasyonu ve Analiz Tavlama Tek-Strand kromozomal Translokasyonlar Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae

Bu prosedürün genel amacı, diploid tomurcuklanma mayası hücrelerinde tek zincirli dizilim yoluyla translokasyon oluşumunun genetik kontrolünü belirlemektir. Bu işlem, öncelikle kültürlerin belirli bir genotipe sahip tek kolonilerle inoküle edilmesi ve gece boyunca büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, kültürlere galaktoz ekleyerek ho endonükleaz aracılığıyla iki kromozom üzerinde eşzamanlı çift zincir kırılması oluşumunu indüklemektir.

Bu kültürlerin bir sonraki dilüsyonları, selektif ve non-selektif besiyerlerine ekilir. Son adım, selektif ve non-selektif besiyerlerinde oluşan koloniler sayılarak translokasyon frekansının belirlenmesidir. Nihayetinde, farklı genotiplere sahip suşlarda uyarılmış translokasyon oluşum frekansındaki değişiklikler üzerinden, translokasyon oluşumunun tek zincir tarafından genetik kontrolünü gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, DNA çift zincir kırılmaları ve translokasyon oluşumu bu tedavinin temel sonuçları olduğu için, kanser hastalarının terapötik radyasyon maruziyetinin sonuçlarına kadar uzanmaktadır. ho stimüle translokasyon frekanslarını belirleme prosedürüne başlamak için, istenen genotipe sahip tek kolonilerle 10 ila 20 bağımsız bir mililitrelik Y peak gliserol laktat ortamı kültürünü inoküle edin ve kültürleri bir rotatör üzerinde 30 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kültürler istenen hücre yoğunluğuna ulaştığında, kültürlere son konsantrasyon %2 olacak şekilde %20 galaktoz ekleyin. Galaktoz, kromozom 3 üzerindeki history delta 5 prim alelinde ve kromozom 15 üzerindeki has 3 delta 3 prim alelinde çift zincir kırılmalarını yönlendirecek olan ho endonükleazın ekspresyonunu indükleyecektir; bir rotatör üzerinde 30 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.

Bir sonraki adım, prosedürün başarısı için kritiktir. Kültürlerin dikkatli bir şekilde seyreltilmesi ve ekilmesi zorunludur. Farklı genotiplere sahip suşlar arasında istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar yapılmasına izin verecek derecede tekrarlanabilir translokasyon frekansları elde etmek için; dört saat sonra, kültürlerin uygun seyreltilerini hem histidin içermeyen besiyerine hem de YPD'ye, plaka başına yaklaşık 100 ila 200 koloni oluşacak şekilde ekin; plakaları 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin.

Koloniler oluştuğunda, translokasyon frekansı belirlenebilir. ho endonükleaz ekspresyonunun indüklenmesinden önceki ve sonraki plakalama verimlilikleri, her iki translokasyon kromozomunun varlığının veya yokluğunun DSB oluşumundan sağ kalma yeteneğini etkileyip etkilemediğini gösterecektir. İndüklenme öncesi plakalama verimliliklerini belirlemek için hem kromozom 3'ün hem de kromozom 15'in bir kopyası fragmanlanır.

İlk olarak, her bir gece boyu süren kültürden bir alikot hücre alın ve hemositometre ile sayım yaparak hücre sayısını belirleyin. Ardından, uygun bir seyreltme kullanarak YPD üzerine yaklaşık 100 ila 200 hücre ekin ve koloniler oluşana kadar 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. İndüksiyon sonrası ekim verimliliğini belirlemek için kalan kültürlere son konsantrasyonu 2% olacak şekilde %20 galaktoz ekleyin ve 30 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.

İndüksiyondan dört saat sonra her kültürden bir hücre alikotu alın ve hücre sayısını hemositometre ile belirleyin. Uygun bir dilüsyon kullanarak plak başına yaklaşık 100 ila 200 hücreyi YPD ortamına ekin ve koloniler oluşana kadar 30 °C'de iki ila üç gün inkübe edin. Plaklarda koloniler oluştuktan sonra ekim verimliliği belirlenebilir. Translokasyon taşıdığı varsayılan klonlar southern blot ile incelenebilir.

Bu prosedür, her bir bağımsız denemenin tek bir hiss artı rekombinant koloninden hazırlanan genomik DNA'yı kullanır; her bir DNA örneğinin yaklaşık dört mikrogramı BAM H I restriksiyon endonükleaz ile sindirilir, BAM H I ile sindirilmiş fragmanlar %0,7 agaroza jelde ayrılır ve ardından HIS3 geni içeren 1,8 KİLOBAZlık bir BAM H I genomik klonunun rastgele primleme ile elde edilen P 32 işaretli probu ile hibridize edilerek pozitif yüklü bir naylon membrana aktarılır. DNA fragmanları autoradyografi veya fosfor görüntüleme ile görselleştirilir. Translokasyon taşıdığı varsayılan klonları incelemenin bir başka yolu ise kromozom haritalama analizidir.

Kromozomlar öncelikle seçilmiş hiss artı rekombinantlarından aros pluglar şeklinde hazırlanır; ayrı kromozomlar %1'lik aros jelinde, 14 °C'de kontur kenetli homojen elektrik alanı veya CHEF ile ayrıştırılır. Şu parametreler kullanılır: birinci blok 14 °C, 72 sn anahtarlama süresi ve 6 V/cm'de 15 saat; ikinci blok 14 °C, 122 sn anahtarlama süresi ve 6 V/cm'de 11 saat. Elektroforez tamamlandığında, jel 30 dakika boyunca EtBr ile boyanarak kromozomlar görünür hale getirilir, ardından UV ile ışınlanır ve distile su ile boyası giderilir; kromozomlar kapiler etkiyle pozitif yüklü bir membrana aktarılır.

Denatüre edici koşullar altında, his3 genini içeren 1,8 kilobazlık bamH1-bamH1 genomik klonunun rastgele primerleme yöntemiyle elde edilen P 32 işaretli prob ile hibridizasyon gerçekleştirilir. Kromozomlar, autoradyografi veya fosfo-görüntüleme ile görselleştirilir. Kromozomal translokasyonların frekansı, histamin fototrofik koloni sayısının YPD plakalarına ekimle belirlenen toplam canlı hücre sayısına bölünmesiyle hesaplanabilir.

Bu örnekte, hesaplanan rekombinasyon frekansı yaklaşık %3'tür. ho stimüle translokasyon frekansları için yapılan analiz, tek zincir aracılığıyla çift zincir kırılmalarını onarma yeteneğindeki farklılıkları karşılaştırmak amacıyla farklı genotiplere sahip suşlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Temsili grafikte gösterildiği gibi. RAD 51 delta null homozigot ile hem seçici hem de seçici olmayan şekilde elde edilen translokasyon frekansları, hem indüksiyon öncesi hem de indüksiyon sonrası ekimle yaban tip suş kullanılarak karşılık gelen koşullarda elde edilenlerden istatistiksel olarak farklıdır.

Verimlilikler, bu tabloda gösterildiği üzere, indüksiyon öncesi ve sonrası ekimlerde, canlı koloni oluşturan toplam hücre sayısının, hemositometre sayımı ile belirlenen kültürdeki toplam hücre gövdesi sayısına bölünmesiyle belirlenir. Yabani tip hücreler için verimlilikler arasında anlamlı bir fark görülmemiştir; bu durum, translokasyon kromozomlarının varlığının veya yokluğunun hayatta kalma yeteneğini etkilemediğini göstermektedir. DSB oluşumu.

Translokasyon taşıdığı varsayılan klonlar, genomik southern blot analizi ile incelenebilir. Translokasyon oluşumu öncesi ve sonrası ilgili kromozomların grafiksel bir gösterimi burada sunulmuştur. Ebeveyn ve rekombinant suşlardan elde edilen genomik DNA'nın BAM H one sindirimi ile oluşturulan ve ilgili dizileri içeren restriksiyon fragmanlarının boyutları, 1.8 kilobase BAM H one ile hibridizasyon yapılarak blotlar üzerinde gösterilmiştir.

Southern blot analizi için HIS3'ün üç genomik klonu kilobaz çiftleri cinsinden listelenmiştir. Genomik DNA, BMH1 endonükleaz ile sindirilir ve bu tanısal fragmanları görüntülemek için P 32 işaretli 1,8 kilobazlık HIS3 probu ile hibridize edilir.

0.8 kilobase HIS3 Δ20, 1.7 kilobase HIS3 Δ3', 4 kilobase T315, 5 kilobase T153 ve 8 kilobase HIS3 Δ5' fragmanları. Şerit A ebeveyn diploidtur. Şerit B bir HIS+ non-resiprok translokasyon rekombinantıdır ve şerit C bir HIS+ resiprok translokasyondur.

Rekombinant kromozomal BLO analizi, translokasyon taşıyan klonları incelemek için de kullanılabilir. Agaroz plug'larda hazırlanan sağlam kromozomlar, CHEF elektroforezi ile ayrılır ve jel, etidyum bromür ile boyanıp UV ışığı altında görüntülenir. Ayrılan kromozomlar daha sonra naylona aktarılır ve P 32 işaretli 1,8 kilobazlık prob ile hibridize edilir.

1.1 megabase sağlam kromozom 3, 15.8 megabase T 15 3 translokasyon kromozomu, 0.6 megabase T 3 15 translokasyon kromozomu ve 0.3 megabase sağlam kromozom 3'ü görselleştirmek için üç prob kullanılmıştır. Şerit A ebeveyn deploiddir. Şerit B bir his+ non-resiprok translokasyon rekombinantı ve Şerit C bir his+ resiprok translokasyon rekombinantıdır.

Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla HO ile uyarılmış çift zincir kırılması sonrası translokasyon oluşum frekansının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.