Etilen Glikol Tabanlı Vitrifikasyon Fare Embriyolar Kriyoprezervasyon

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyolarını sıvı azot içinde kriyoprezerve etmek ve canlı farelerin elde edilmesi için onları çözdürmektir. Bu işlem, öncelikle fare embriyolarının dengeleme ortamına daldırılması, ardından bir kriyotüp içinde vitrifikasyon ortamına aktarılması ve sonrasında sıvı azot tankına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra embriyolar, yüksek ozmotik bir ortamda çözdürülebilir ve alıcı dişilere transfer edilene kadar kültür ortamında inkübe edilebilir.

Nihai olarak, sonuçlar vitrifikasyon çözünmesinin ardından embriyoların %90'ından fazlasının hayatta kaldığını ve embriyo transferi sonrası doğum oranlarının %30 ile %70 arasında olduğunu göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı, geçirgen kriyoprotektan glikolün embriyolar için geleneksel kriyoprotektanlara göre daha az toksik olmasıdır. Bu prosedür, protokol başlamadan önce laboratuvarımdan bir teknisyen tarafından gösterilecektir.

Doğal çiftleşme veya geleneksel IVF teknikleriyle elde edilen iki hücreli fare embriyolarını, nihai saklama için bir kriyotüpe hazırlayın ve 50 µL embryo dondurma çözeltisi EF S 40 ekleyin. Ardından, 35 mm veya 60 mm'lik plastik bir Petri kabını 50 µL oda sıcaklığındaki EFS 20 ile hazırlayın.

30 adede kadar embriyoyu kaba aktarmak için cam bir kılcal tüp kullanın. Kültür ortamının aktarılmamasına dikkat edin. Ayrıca embriyoların dehidrasyonunu önlemek için onları damlanın tabanına yerleştirin.

Yaklaşık 60 ila 90 saniye sonra, büzülmüş morfolojiye sahip olan dehidrate embriyoları çekmek için bir kapiler tüp kullanın. Bu embriyoları, mümkün olduğunca az EFS 20 transfer ederek kriyo tüpündeki EFS çözeltisine taşıyın.

Embriyolar transfer edildikten sonra, sıvı azot içinde dondurmadan önce EFS 40 içerisinde bir dakika boyunca dinlenmelerini bekleyin. Embriyoları çözmeden önce, bir kültür kabına M 16 medium gibi yüksek ozmolariteli embriyo kültür ortamından en az iki damla (her biri 10 µL) yerleştirin. Ardından damlaların üzerini tamamen silikon veya mineral yağ ile kapatın ve kabı kullanıma kadar bir karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Ardından, yüz maskesi ve kriyojenik eldivenler giymiş halde TS one çözeltisini 37 °C'ye ısıtın. Embriyoları sıvı azot tankından çıkarın. Şimdi kriyotübü hızla açın ve varsa sıvı azotu tanka veya uygun bir kaba boşaltın.

Ardından 30 saniye bekleyin. Şimdi kriyotüpe 850 µL ılık TS one çözeltisi ekleyin. Çözeltinin eşit şekilde çözünmesi için yaklaşık 10 kez nazikçe çekip püskürtün.

Ardından hacmin tamamını 60 milimetrelik plastik bir Petri kabına veya saat camına aktarın; embriyoların, prosedürün geri kalanı boyunca kalacakları oda sıcaklığına alışmaları için üç dakika bekleyin. Isıtıcı bir cihaz kullanmayın.

İnkübasyonun başlangıcındaki görünümlerini belirlemek için kapta bulunan embriyoları bir stereo mikroskop altında hızlıca inceleyin. Yaklaşık iki dakikalık inkübasyonun ardından, besiyeri kabın yüzeyine yayılana kadar kabı nazikçe sallayarak embriyoları batırın. İnkübasyonun son dakikasında, bir kaba üç ayrı 50 µL TS two çözeltisi damlası bırakın.

Üç dakika dolduğunda, embriyoların hafifçe büzüldüğünü onaylamak için bir stereo mikroskop kullanın. Embriyolar hâlâ şişkinse, inkübasyona bir ila üç dakika daha devam edin. Şimdi, embriyoları bir cam kılcal boru ile alın ve TS iki'nin ilk damlasına aktarın.

Üç dakika bekleyin ve embriyoları ikinci damlaya aktarın. Ardından üçüncü damlaya aktarın. Son olarak, inkübatörde saklanan hazırlanmış embriyo ortam kabını çıkarın ve embriyoları ortamın ilk damlasına aktarmak için bir cam kılcal tüp kullanın.

Stereoskop altında incelendiğinde, embriyolar yavaşça normal morfolojilerini geri kazanmalıdır. Şimdi, kabı yaklaşık 10 dakika boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Ardından, TS iki'den taşınan sakkarozu yıkamak için işlem yapın.

Embriyoları bir sonraki kültür ortamı damlasına taşıyın. Embriyolar alıcı dişilerin uc'sine transfer edilene kadar CO2 inkübatöründe kültürlemeye devam edin. Üç farklı fare suşundan 300 ile 480 arasında embriyo vitrifike edilip geri kazandırıldıktan sonra, sağkalım oranı oldukça yüksek bulunmuştur.

Çözme işleminden sonra, normal morfoloji gösteren embriyo oranı %93 ile %99 arasındaydı ve bu embriyoların en az %84'ü blastokiste dönüştü. Sızdıran azotla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini, doğrudan temastan kaçınmak ve kısa mesafeli maruziyeti en aza indirmek için önlemler alınması gerektiğini unutmayın. Azot alımı her zaman bu prosedür uygulanarak gerçekleştirilmelidir.