Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Aşağıdaki deneyin genel amacı, protein absorbsiyonunu ve hücre büyümesini kontrol etmek için iki boyutlu desenli bir substrat geliştirmektir. Bu, mikro kontak baskı için A-P-D-M-S stempel üretmek amacıyla kullanılan desenli bir ana kalıbın fotolitografi ile imal edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, protein emen ve proteinle direnç gösteren bölgeler içeren bir desen oluşturmak için mikro kontak baskının uygulandığı desenli altın substrat hazırlanır.

Ardından, deseni görselleştirmek ve çalışmak amacıyla substrata protein ve hücreler eklenir. Floresans ve faz kontrast mikroskobisine dayalı olarak, bu desenli substratlar üzerinde protein ve hücrelerin iyi bir şekilde hapsedildiğini gösteren hücresel büyüme ve davranış sonuçları elde edilir. Bu tekniğin, proteinlerin MicroCon baskısı gibi mevcut diğer yöntemlere göre temel avantajı, glikol terminasyonlu monokatmanın desenin arka planında spesifik olmayan protein ve hücre absorbsiyonunu engellemesidir.

Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, basılan her desen için uygun damgalama tekniğinin optimize edilmesi gerektiğinden zorluk yaşayabilirler. Desenli ana merkez hazırlığına başlamak için, spin kaplayıcı üzerindeki silikon gofretle başlayın ve iki döngülü spin programının ilk aşamasında gofreti aseton ile durulayın. Spin programının ikinci aşamasında, aseton buharlaşarak temiz ve kuru bir gofret bırakacaktır; spinleme başlangıcında gofrete fotoresist uygulayın ve ardından daha önce açıklanan koşulları kullanarak spin kaplama işlemini gerçekleştirin.

Fotoresist kaplı gofret, yüksek homojenlikte bir ısıtıcı plaka kullanılarak 110 degrees Celsius sıcaklıkta iki dakika boyunca yumuşak pişirmeye (soft bake) tabi tutun. Ardından, bir maske hizalama sistemi ve uygun bir maske kullanarak fotoresist kaplı gofret üzerinde fotopattern oluşturun.

Öncelikle, altlığı maske hizalayıcının vakum tablasına yerleştirin. Ardından maskeyi tutucu tepsiye yerleştirin ve maskenin altlıkla iyi temas ettiğinden emin olmak için maskeyi sabitleyecek şekilde vakumu açın. Altlığı, maskeyle buluşana kadar yukarı kaldırın.

İyi temas sağlandığını onaylamak için hizalayıcının optiklerini kullanın. Son olarak, litografik maske aracılığıyla substratı UV ışığına maruz bırakmak için lambayı açın. Desenlenmiş gofretle bir dakika 45 saniye boyunca, hafif ajitasyonla geliştiricide geliştirme işlemi yapın.

Yarı iletken sınıfı, deiyonize su ile iyice durulayın ve bir nitrojen gazı akımıyla kurulayın; UV filtreli bir mikroskop kullanarak desen gelişimini kontrol edin. Bu prosedüre, ağırlıkça 10'a bir oranında reçine sertleştirici hazırlayarak başlayın. Karışımı tamamen karıştırın.

Fotoğraf desenli gofretle karışımı tek kullanımlık bir Petri kabında vakumlu desikatörde örtün. PDMS kaplı master'daki hava kabarcıkları tamamen kaybolana kadar gazını alın. Master'ın kabın tabanında olduğundan emin olduktan sonra, damganın 65 °C'deki fırında 1,5 saat boyunca kürlenmesine izin verin. PDMS damga kürlendiğinde, damgayı master'dan kesin ve uygun boyuta göre kırpın.

Damgayı, toz ve kalıntılardan korumak için özellikli yüzeyi yukarı bakacak şekilde kapalı bir kapta saklayın. Metal biriktirme işlemi için altlıkları hazırlamak amacıyla, önce yuvarlak cam kapatma lamlarını 10 dakika boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın. Ardından, kapatma lamlarını deiyonize su ile iki kez durulayın ve durulamalar arasında azot gazı akımıyla kurulayın; suyla durulamayı takiben, ethanol ile iki kez daha durulayın ve yine durulamalar arasında azot gazı akımıyla kurulayın.

Çok cepli bir elektron ışınla biriktirme sistemi kullanarak, önce 50 angstrom titanyum, ardından 150 angstrom altın biriktirin. Titanyum tabakası ile altın tabakasının biriktirilmesi arasında evaporatörü havalandırmayın. PDMS damgasını etanol ile durulayın ve tamamen kurulayın.

Azot gazı eşliğinde, damgalama çözeltisini damga tamamen kaplanana kadar damla damla uygulayın. Damgayı azot gazı ile iyice kurulayın. HEXA Decane dosyasının mikro temas baskısı, PDMS damganın özelliklerine bağlıdır ve bu prosedürün en zor yönlerinden biridir.

Başarılı damgalama, eşit basınç uygulayan iyi bir tekniğin geliştirilmesini gerektirir. Damgalama sırasında; hava ortamında gerçekleştirilen konvansiyonel mikro temas baskılama için, damgayı altın substrat üzerine nazikçe bastırın ve tek tabakanın oluşması için 15 saniye bekleyin.

Alternatif olarak, çok küçük özelliklerden ve yüksek en-boy oranlarından oluşan desenler için, altın alt tabakayı 18.2 mega om deiyonize su içeren bir Petri kabına yerleştirerek alt tabakanın tamamen daldırıldığından emin olun. Ardından, damgayı altın alt tabakanın üzerine nazikçe bastırın ve mono tabakanın oluşması için 15 saniye bekleyin. Sonrasında, damgalanmış alt tabakayı iki kez etanol ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurutun.

Her durulamadan sonra, substratı bir Petri kabına yerleştirin ve substratı arka doldurma solüsyonu ile kaplayın. Buharlaşmayı önlemek için kabı parafilm ile mühürleyin. Arka plan monotabakasının karanlıkta 12 ila 14 saat boyunca oluşmasını bekleyin.

Son olarak, desenli lamelini geri dolgu çözeltisinden çıkarın ve her durulama işleminden sonra nitrojen gazı ile kurutarak etanol ile iki kez durulayın. Proteini desenli lamelin üzerine uygulamak için, lameli küçük bir Petri kabına veya bir hücre kültürü odasına yerleştirin. Üzerini 500 µL ile 1 mL arasında DPBS (delcos fosfat tamponlu tuzlu su) ile kaplayın. Protein inkübasyonu sırasında DPBS'nin substratı tamamen kaplaması gerekir.

Protein kapsamının homojen olmasını sağlamak için, konsantre bir protein çözeltisini DPBS'ye ekleyin ve çözeltiyi pipetleme yöntemiyle birkaç kez karıştırın. Protein karışımını substrat ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için substratı DPBS ile iyice durulayın; bu sırada substratın kurumamasına veya hava-su ara yüzeyine getirilmemesine dikkat edin.

Üç durulamadan sonra DPBS'yi aspire edin. Ardından, substratın ıslak kalmasını sağlamak için yaklaşık 500 microliter complete hücre büyüme medyumu ekleyin. Substratı durulamak için kullanılan büyüme medyumunu değiştirin.

Taze besiyeri ile birlikte, substrat artık hücre ekimi için hazırdır. Tipik olarak, substrat üzerine milimetrekare başına 30 ila 200 hücre ekilir. Bu görüntü, A-P-D-M-S damganın, damga özelliğine sahip tarafı bir lam üzerine gelecek şekilde yerleştirilerek mikroskop altında görselleştirilmesini göstermektedir; ölçek çubuğu 100 micrometers değerindedir.

Doğru damgalama, LOR 6 47 ile işaretlenmiş fibronektin gibi floresan işaretli bir protein uygulanarak görselleştirilebilen keskin ve net bir protein deseni ile sonuçlanır. chk one hücrelerinin protein desenine sınırlanması burada gösterilmiştir. Bu görüntülerdeki ölçek çubukları 100 micrometers boyutundadır.

Alternatif olarak, SU fiksasyonundan sonra protein paternini görüntülemek için immünohistokimya kullanılabilir. Burada, E 18 fare hipokampal nöronları ekilmiş paternli laminatı görüntülemek için LOR 647 konjugatlı anti-laminat antikor kullanılmıştır; in vitro dördüncü günde E 18 fare hipokampal nöronları MitoTracker Red 580 ile boyanmış olup hücre büyümesinin protein paterni ile iyi sınırlandırıldığını göstermektedir. Bu teknik kolayca öğrenilse de, LOR 647 konjugatlı fibronektin absorbsiyonu ile görüntülenen şu patern substrat preparatlarında örneklendiği üzere, bazı yaygın sorunlar ortaya çıkabilir.

Konsantre protein solüsyonunun DPBS içinde yeterince karıştırılmadan uygulanması, düzensiz protein desenlerine yol açabilir. Hatalı damgalama, desenin kısmi transferine veya damganın çökmesine neden olabilir. Ayrıca, absorbe edilmiş protein içeren desen alt tabakasının havaya maruz kalması, tek tabakayı bozarak direncin azalmasına yol açabilir.

Arka planda, daldırma desenleme, geleneksel mikro temas baskılama ve hava ortamında basılması zor olan küçük özelliklere sahip desenler oluşturabilir. Bu iki görüntü, aynı PDMS damgasıyla havada veya deiyonize su içinde basılan aynı desenin farklı bölgelerini göstermektedir; sol taraftaki görüntüde yer alan destek çizgileri, desenin yalnızca küçük özelliklerinin başarılı bir şekilde basılamadığını kanıtlamaktadır. Ölçek çubukları 20 micrometers değerindedir. Bu tekniğe hakim olunduğunda, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde işlem 18 ila 24 saat içinde tamamlanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, desenli bir altlık hazırlamanın nasıl yapıldığına dair iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. PDMS damga üretiniz. Desenli altın altlık hazırlamak için mikro temas baskı yöntemini kullanınız ve bu deseni proteinler ile hücreler yardımıyla görselleştiriniz.