Standart Mürekkep Püskürtmeli Yazıcı Kullanımı Geçici Hücre Zarı Gözenekler oluşturma

Bu prosedürün genel amacı, mürekkep püskürtmeli yazdırma yöntemiyle hücre membranlarında geçici porlar oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle standart bir mürekkep püskürtmeli yazıcının modifiye edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise, biyomürekkebin yerleştirilmesine olanak sağlamak için standart bir yazıcı mürekkep kartuşunun boşaltılması ve temizlenmesidir.

Ardından, biyomürekkep çözeltisini oluşturmak için incelenen hücreler, floresan işaretli aktin monomerleri ve PBS içeren bir çözeltide süspanse edilir. Son adım, modifiye edilmiş yazıcı ve kartuş kullanılarak biyomürekkebin mikroskop lamları üzerine basılmasıdır. Nihayetinde, Fluor four konjuge G aktin monomerlerinin, geçici membran gözenekleri aracılığıyla basılan hücreler tarafından içselleştirildiğini göstermek için floresan mikroskopi kullanılabilir.

Bu tekniğin standart transfeksiyon ve hücre mikroenjeksiyon tekniklerine göre temel avantajı, bu yazdırma tekniğinin kullanımının kolay olması ve yüksek hücre canlılığı sağlamasıdır. Bu teknik genetikte içgörü sağlayabildiği gibi, hücre biyofiziği ve doku mühendisliği gibi diğer çalışma alanlarına da uygulanabilir. Bu teknik, hücre göçü sırasında bir hücrenin hücre iskeletini kolayca gözlemlemek için kullanılabilir.

Bu yöntem için ilk fikri, hücrelere uygulanan kuvvetler nedeniyle sitoskelet düzenlemesinde meydana gelen değişiklikleri görselleştirmek istediğimizde geliştirdik. Yazıcının alt tabanındaki plastik klipslerin kilidini açarak başlayın ve ardından üst plastik kasayı yavaşça kaldırın. Daha sonra, düğme ekran ışık panelini yazıcının anakartına bağlı bırakarak yazıcının üst kısmından ayırın.

Kim mendilleri ve etanol kullanarak yazıcının iç kısmını, özellikle mürekkep kartuşunun yerleştiği ve yazdırma işleminin gerçekleştiği alanları temizleyin. Ardından, HP desk Jet 500'ün kağıt besleme mekanizmalarına güç sağlayan kabloyu bulun.

Bunlar, ön tarafın solunda, kağıt tepsisinin hemen altındadır; kabloları anakarttan çıkarın. Şimdi kağıt algılama mekanizmasını bulun ve manuel bir tutamak görevi görmesi için yazdırma kağıdı besleme mekanizmasının üstünde ve arkasında bulunan gri plastik mandala bir tel halka sabitleyin, buraya bir tabla yerleştirin. 15 santrifüj tüpü için kullanılan köpük taşıma tutucusu, istenen yazdırma lamlarını kartuş yazıcı kafasının hemen altındaki bir seviyeye getirmek amacıyla, kağıt besleme mekanizmasının önündeki yazdırma bölgesine bantla sabitlenmiş birkaç mikroskop lamı ile birlikte kullanılır.

Son olarak, aseptik tekniği korumak için yazıcıyı laminer akışlı kabin içerisine yerleştirin. Yazıcı kontaklarını ve baskı kafasını örten koruyucu bantları bırakarak, kartuşu paketinden çıkararak başlayın. El tipi döner kesme aleti kullanarak, kartuşun yeşil üst kısmını herhangi bir engelden uzak tutacak şekilde gövdesini bir kelepçe ile sabitleyin.

Kartuşun yeşil üst kısmını kesin, haznedeki kalan tüm mürekkebi boşaltın ve ardından yazıcı temas noktaları ile yazıcı kafasını örten plastik koruyucu bandı çıkarın. Bu işlem sırasında yazıcı kafasından muhtemelen su sızacaktır ancak bu durum kartuşa herhangi bir zarar vermez. Su berrak akmaya başladığında kartuşun kurumasına izin verin.

Temiz bir baskı ortamı sağlamak için, işleme kartuşu deiyonize suyla dolu bir behere tamamen daldırarak başlayın ve ardından kartuşu 15 dakika boyunca sonikasyon işlemine tabi tutun. Sonikasyondan sonra kartuşu çıkarın ve fazla suyu silkeleyerek uzaklaştırın. Daha aseptik bir ortam oluşturmak için kartuşun içine %70 etanol püskürtün.

İlgilenilen hücreler hasat edildikten sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik santrifüj tüpü içerisinde beş mililitre taze besiyerinde, oda sıcaklığında 250 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, besiyerini aspire edin ve hücreleri yeni hazırlanmış floresan G aktin stok çözeltisi içerisinde 1 × 10⁵ hücre/mililitre konsantrasyonda yeniden süspande edin. Bio-mürekkep hazırlarken, 250 µL bio-mürekkebin burada gösterilen çizgi desenine sahip üç lamelle basım yaptığını unutmayın. Yazıcı açılıp ısındıktan sonra, istenen baskı yüzeyini buraya yerleştirin; önceden monte edilmiş tablasının merkezinde 22 mm × 22 mm boyutlarında lamel kullanılır.

Ardından, bir çizim yazılımı programı açın ve istenen deseni seçin. Şimdi, kartuş bölmesinin altındaki küçük dairesel kuyucuğa yaklaşık 100 ila 120 µL hücre süspansiyonu pipetleyin. Yazıcı yeniden ısınırken dosyayı yazdırın, kartuş hazır konumuna gelecektir.

Kartuş, mürekkep damlama haznesinin hafifçe soluna hareket edip orada kaldığında; kağıt besleme mekanizmasını ve teli yukarı çekin, ardından yazdırma işlemi başlayacaktır. Yazıcı, G aktin monomer çözeltisi içindeki bir fibroblast hücresi süspansiyonundan oluşan bir biyo mürekkep ve HP desk jet 500 yazıcı kullanarak, yazdırma tablasının merkezine yerleştirilen lamine üzerine baskı yapacaktır.

Bir HP 26 serisi içerisinde, mürekkep kartuş hücreleri cam mikroskop lamel üzerine basılmıştır. Bu şekil, floresan aktin monomerlerinin dahil olduğu basılmış fibroblast hücrelerinin temsili bir sonucunu göstermektedir. Bu desen, önceki şekilde mikroskop lamının büyük bir kısmı boyunca baskı çözeltisinden oluşan sürekli bir hat oluşturmak için kullanılmıştır.

Bu şekilde, biyomürekkep ve hücrelerin karşılıklı olarak yerleştirildiği düz hat gösterilmiştir. Baskıdan hemen sonra, hücrelerin süspande edildiği biyomürekkep solüsyonunun serbest fazla floresan aktin monomerleri içerdiğinden dolayı arka plan floresansında bir artış olduğu görülmektedir; baskı sonrası hücrelerin yaklaşık 10 dakika boyunca inkübe edilmesi lam üzerine yapışmayı kolaylaştırır ve fazla monomer solüsyonunun taze büyüme medyumları ile substrattan yıkanmasına olanak tanıyarak arka plan floresansını önemli ölçüde azaltır. Burada, yerelleştirilmiş bir baskı bölgesine basılan üç 3T3 fibroblastinin temsili bir görüntüsü yer almaktadır; baskıdan 15 dakika sonra alınan bu hücre floresan mikroskopi mikrografı, G-aktini yeşil, çekirdeği mavi ve hem G-aktininin hem de nükleer boyanın üst üste bindirilmiş görüntüsünü göstermektedir.

Sonraki iki görüntü, yazdırmadan üç saat sonra çizgi desenindeki iki fibroblastın floresan mikroskobisini göstermektedir. Bu ilk görüntü, hücrelerin içindeki floresanla işaretlenmiş aktin monomerlerini göstermektedir. Bu ikinci görüntü, sol alt köşedeki lam üzerinde bazı kalıntılar olabilmesine rağmen bunların floresan yaymadığını göstermek için floresan kanalının arka plan görüntüsüyle üst üste bindirilmiş halidir.

Son olarak, hücre basımı yoluyla membran permeasyonu gerçekleşmeden monomerlerin hücre membranına nüfuz edemeyeceğini göstermek amacıyla, floresan işaretli monomerlerle üç saat boyunca inkübe edilen basılmamış hücrelerden oluşan bir kontrol grubu burada sunulmuştur. Bu prosedürü uygularken, yazıcı tıkanması tekniği yavaşlatan sorunlardan biri olduğundan, birkaç kartuşun temizlenmiş ve kullanıma hazır olması önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, geçici membran kuvveti oluşturmaya yardımcı olan standart bir masaüstü yazıcının canlı hücreleri basacak şekilde nasıl dönüştürüleceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.