DNA Metilasyonu: bisülfit modifikasyonu ve Analiz

Bu prosedürün genel amacı, sülfit ile dönüştürülmüş DNA'nın genomik dizilemesi yoluyla CpG dinükleotidlerinin DNA metilasyon analizini gerçekleştirmektir. Bu, öncelikle çift zincirli DNA'nın denatüre edilmesiyle sağlanır, böylece bisülfit dönüşüm reaksiyonu gerçekleşebilir. İkinci adım, genomik DNA'daki tüm metillenmemiş sitozinlerin bisülfit deaminasyonu ile urasile dönüştürülmesidir.

Bu reaksiyon üç aşamadan oluşur. Birincisi, beş altı çift bağın sülfit B eklenmesiyle sitozin kalıntısının sülfatlanmasıdır. İkinci olarak, sülfit türevi tarafından sitozinin hidrolitik deaminasyonu bir SSL sülfit türevi üretir ve üçüncü olarak, alkali işlemle sülfonat grubunun uzaklaştırılması bir SSL kalıntısı ile sonuçlanır.

Ardından, hedef bölge bisülfit dönüşümüne özgü primerler ve PCR amplifikasyonu ile çoğaltılır. Son adım, DNA molekülü boyunca metilasyon için tek nükleotid çözünürlüğü sağlamak amacıyla PCR ürününün klonlanması ve dizilenmesidir. Sonuç olarak, asidik koşullar altında sitozinin beş metil sitozine kıyasla bisülfat deaminasyonuna karşı artan duyarlılığından yararlanılarak, genomik DNA'daki CpG dinükleotidlerinin DNA metilasyonu gösterilir.

Bu tekniğin southern kan analizle gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, DNA metilasyonunun tek nükleotid çözünürlüğünde belirlenmesine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, kanser gibi insan hastalıklarında DNA metilasyonunun rolü gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. DNA örneklerini bisülfit dönüşümüne hazırlamak için, öncelikle 2 µg genomik DNA'yı bisülfit, DNA lizis tamponu ve toplam 18 µL hacim ile 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Ardından, son konsantrasyon 0.3 M olacak şekilde, taze hazırlanmış 3 M sodyum hidroksitin iki mikrolitresini ekleyerek genomik DNA'yı denatüre edin. Numuneleri bir su banyosunda 37 °C'de 15 dakika, ardından 90 °C'de iki dakika inkübe edin. Bir ısı bloğundan çıkardıktan sonra tüpleri hemen beş dakika boyunca buza yerleştirin ve DNA'nın tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri 10.000 G'de 10 saniye santrifüjleyin; denatüre DNA numuneleri artık bir sonraki aşamada gösterilecek olan B hücresi deaminasyonuna hazırdır.

Sülfasyon ve hidrolitik deaminasyon reaksiyonlarından önce, 10 millimolar quinol ve pH 5,0'da doymuş sodyum metabisülfit taze çözeltilerini hazırlayın. Sodyum metabisülfit doymuş bir çözelti olduğu için, küçük topaklar çözünmeden kalabilir. 20 microliters denatüre DNA'ya, nihai hacim 240 microliters olacak şekilde 208 microliters sodyum metabisülfit ve 12 microliters quinol ekleyin.

Tüpleri vorteksleyin ve tüm damlacıkların tüpün dibine çöktüğünden emin olmak için 10 saniye boyunca santrifüjleyin. Örneklerin üzerine mineral yağı ekleyin. Dönüştürülecek DNA'nın miktarına ve kalitesine bağlı olarak, örnekleri bir su banyosunda 55 °C'de dört ila 16 saat boyunca inkübe edin.

Oksidasyonu önlemek için bisülfit dönüşümünün karanlıkta gerçekleşmesi önemlidir. Uygun inkübasyon süresinin sonunda, tüm sıvının tüpün dibinde olduğundan emin olmak için tüpleri bir mikro santrifüjde kısa süreliğine döndürün. Ardından, mineral yağdan hiç almadan, DNA solüsyonunu tüpün dibinden dikkatlice pipetle çekin.

Sıradaki adımlar için laboratuvarımız Promega Wizard DNA temizleme sistemini kullanmaktadır. DNA örneklerine bir mililitre reçine ekleyin, karıştırmak için tüpü ters çevirin ve ardından solüsyonu tuz giderme kolonuna bağlı bir şırıngaya pipetleyin. Son olarak, serbest bisülfit iyonlarını gidermek için bisülfit ile işlem görmüş DNA'yı tuz giderme kolonundan geçirin ve 50 µL Milli Q su ile elüe edin.

Sıradaki adım, tuz giderme yoluyla urasil halkasındaki bisülfit grubunu uzaklaştırmaktır. Bunu gerçekleştirmek için, nihai konsantrasyon 0,3 molar olacak şekilde, her bir bisülfitle işlenmiş DNA örneğine 5,5 µL taze hazırlanmış üç molar sodyum hidroksit ekleyin. Ardından örnekleri 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.

Numuneleri kısa süreliğine santrifüjleyin ve ardından her numuneye bir mikrolitre TRNA ekleyin. Son konsantrasyonu üç molar olacak şekilde amonyum asetat ekleyerek çözeltiyi nötralize edin. Sonrasında, DNA'yı etanol ile çöktürün.

330 µL buz gibi %100 etanol ekleyin ve ters çevirerek iyice karıştırın. Bir saat boyunca veya gece boyunca -20 °C'de bekletin, ardından 4 °C'de 14.000 ×g hızında 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanın tüm kalıntılarını uzaklaştırın ve çöktürülmüş DNA'yı yaklaşık 20 dakika boyunca havada kurutun.

Hava ile kuruttuktan sonra, pellet neredeyse görünmez hale gelir; DNA pelletini 50 µL 0.1 XTE veya su içerisinde yeniden süspande edin ve oda sıcaklığında yaklaşık iki saat bekletin. Bu süre zarfında, DNA'nın çözündüğünden emin olmak için tüpleri ara ara vorteksleyin ve ardından hızlıca santrifüjleyin. DNA çözündüğünde, miktarına ve kalitesine bağlı olarak -20 °C'de 1 ila 10 yıl boyunca saklanabilir veya hemen kullanılabilir. PCR amplifikasyonu için primer optimizasyonu, bu prosedürün en zor kısmıdır.

Bu nedenle, primer tasarımının başarısını sağlamaya yardımcı olmak için aşağıdaki kılavuzlar sunulmuştur. Bu kılavuzları örneklendirmek için hedef sekans sülfit ile dönüştürülmüştür; böylece yazıldığında dönüştürülmüş sitozinler mavi T'ler, dönüştürülmemiş CpG bölgeleri ise kırmızı cg'ler olarak görünür. Özgüllüğü sağlamak için primerler 24 ila 30 baz çifti uzunluğunda olmalıdır. Primerlerin tahmini TM değerleri 50 °C'nin üzerinde ve birbirlerinden en fazla bir ila iki °C farklı olmalıdır.

Dönüşüm spesifikliğini sağlamak için primerler yaklaşık %25 oranında C'den T'ye bazlar içermelidir. Amplifikasyonun sağlanması için üç primer ucundaki son baz C'den T'ye olmalıdır. Metillenmiş, metillenmemiş veya dönüştürülmemiş şablonlara karşı potansiyel yanlılığı önlemek için primer dizisinde dönüştürülmüş D-N-A-C-P-G dinükleotidlerinden kaçınılmalıdır. Ancak, bundan kaçınılamıyorsa, dönüştürülmüş DNA'nın tarafsız amplifikasyonunu sağlamaya yardımcı olmak için CPG bölgesindeki sitozin Y ile değiştirilmelidir.

Son olarak, gerekliyse PCR reaksiyonunun özgüllüğünü veya hassasiyetini sağlamak için iç içe (nested) veya yarı iç içe (semi-nested) primer setleri tasarlayın. Optimizasyon için PCR amplifikasyon reaksiyon karışımlarını 25 microliter'lik alikotlar halinde hazırlayın. Metillenmiş veya metillenmemiş materyalin amplifikasyon yanlılığını test etmek için her reaksiyon; sülfit ile dönüştürülmüş genomik DNA, DPS primerleri, magnezyum klorür, potasyum klorür, tris hidroklorür pH 8.3 ve anac polimeraz içerir.

Bisülfit dönüşümüyle orantılı PCR amplifikasyonunu test etmek için %50 metillenmiş ve %50 metillenmemiş, tamamen bisülfit dönüşümüne uğramış bir kontrol örneği kullanın. Spesifik primerler ve PCR reaksiyon karışımı ile sıcaklık gradyanlı bir termosiklet cihazında, sekiz ila on tüpe yayılmış şekilde primerin TM değerinin artı veya eksi 3 °C gradyanında reaksiyonu başlatın; tüpleri vorteksleyin ve termosiklete yerleştirmeden önce bir mikro santrifüjde kısa süreliğine döndürün. Bu şekil, %50 metillenmiş ve metillenmemiş DNA karışımından elde edilen sıcaklık gradyanlı PCR amplifikasyon profilini içeren bir agaroz jeli göstermektedir.

PCR amplikonları ve T ile işaretlenmiş iki, beş ve sekizinci şeritler, yalnızca metillenmiş DNA'yı sindirecek bir restriksiyon enzimi ile işlenmiştir; optimal PCR amplifikasyon koşulları, metillenmiş ve metillenmemiş amplikonları orantılı ve yanlılık olmaksızın amplifiye etmeli ve burada görüldüğü gibi eşit miktarda kesilmiş ve kesilmemiş PCR ürünü ile sonuçlanmalıdır. Yanlılık içermeyen amplifikasyon için optimal termodöngü koşulları 55.6 °C'dir. Bisülfit DNA'nın tam dönüşümü, yalnızca dönüştürülmemiş DNA'yı sindirecek bir sitozin bölgeye özgü enzim ile üç, altı ve dokuzuncu şeritlerin sindirilmesi yoluyla analiz edilebilir.

Tam bisülfit DNA dönüşümü, üç şeridin tamamında (üçüncü, altıncı ve dokuzuncu şeritler) kesilmiş DNA'nın bulunmamasıyla burada gösterilmiştir. Bu gerçek zamanlı ayrışma grafiği, sırasıyla 82,9 °C ve 86,9 °C'de ayrışan tamamen metillenmiş (pembe çizgi m) ve metillenmemiş (yeşil çizgi U) DNA'ların kontrol amplifikasyonuna kıyasla, eşit oranda metillenmiş ve metillenmemiş DNA'dan oluşan (kırmızı turuncu çizgi %50 %50 karışım) bir oran göstermektedir. Bu durum, farklı moleküllerin ayrışacağı sıcaklığa dayalı bir amplifikasyon yanlılığı olmadığını göstermektedir.

Bisülfit ile işlenmiş örneklerin amplifikasyonundan elde edilen PCR fragmanları, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilebilir ve dizilenebilir. Burada, üç farklı hücre hattına ait, CpG bölgeleri sarı ile vurgulanmış bir dizileme izi doğrudan gösterilmektedir; hücre hattı X tüm üç CpG bölgesinde %100 metilasyon sergilerken, hücre hattı Y ve Z, burada gösterilen örtüşen G ve A sinyallerinden anlaşıldığı üzere farklı derecelerde metilasyon göstermektedir. Şekil 4A, üç farklı hücre hattına ait, CpG bölgeleri sarı ile vurgulanmış bir dizileme izidir.

Tekil klonların doğrudan dizilenmesinin ardından, tekil moleküllerin metilasyon durumu bir bisülfit haritasında tablolaştırılabilir. Metilasyon heterojenliğini görselleştirmek için, tekil CpG bölgelerindeki metilasyon yoğunluğu kırmızı ile gösterilmiştir. Bu temsili bisülfit haritasında, bir örneğin yüksek verimli kantitatif metilasyon analizi sunulmaktadır.

Sequenome epi typer teknolojisinin kullanımı, Şekil 5 A'da gösterildiği gibi, metillenmiş sitozinlerin varlığına bağlı olarak spesifik bir spektrum oluşturabilir. Örnekteki oranların özeti daha sonra bir epigrama (Şekil 5 B) dönüştürülebilir. Bu örnek, dört farklı hücre hattı için her bir CpG bölgesindeki DNA metilasyon yüzdesini göstermektedir. Son olarak, geliştirilen epigramdan bir metilasyon grafiği özeti (Şekil 5 C) elde edilebilir. Bu teknik, epigenetik alanındaki araştırmacıların DNA metilasyonunu ve bunun insan hastalıklarındaki rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.