PDMS Cihaz İmalat ve Yüzey Modifikasyonu

Benim adım Ken Kotz. Massachusetts General Hospital ile bağlantılı Bio MAs Resource Center'da doktora sonrası araştırmacıyım. Ana araştırma projem, mikroakışkan yapılara sahip bir immün afinite yakalama cihazı kullanarak nötrofillerin izole edilmesini içermektedir.

Alt akış genomic analizleri için RNA izole etmek amacıyla bu cihazı ülke genelindeki beş farklı hastanede kullanıyoruz. Temel olarak, silikon üzerinde bir SU 8 fotoresist kalıba sahibiz. Bu kalıbın üzerine iki bileşenli bir elastomer olan A-P-D-M-S dökeceğiz ve bu PDMS bir kalıp oluşturacak.

Ana kalıbı kutusundan çıkarıp bir Petri kabına yerleştiriyoruz. Ana kalıp, bir Petri kabının tabanına bantla sabitlenir. Terazi üzerinde PDMS, sertleştirici ve baz reçine karışımını tartıyoruz.

Sertleştirici ile reçine oranı bir birim sertleştiriciye on birim reçine şeklindedir. Genellikle, kesilmiş cihazlarımız için 20 ila 30 gram reçine ve sırasıyla iki ila üç gram sertleştirici tartarız. Hem sertleştiriciyi hem de reçineyi küçük bir tartım kabına döktükten sonra, ikisini birbirine karıştırmak için standart bir plastik çatal kullanırız.

Sertleştiricinin reçine içinde eşit şekilde dağıldığından emin olmak için karışımı kuvvetlice karıştırdığınızdan ve üst üste katladığınızdan emin olmalısınız. Genellikle, ikisinin ne kadar iyi karıştığını izleriz. Hava kabarcıklarının sayısına bakarak, elastomer boyunca küçük hava kabarcıklarının eşit bir dağılımını elde etmeye çalışırız.

Ardından, PDMS'i Petri kabındaki SU eight kalıbının üzerine döküyoruz. Üzerinde PDMS bulunan kalıbı bir vakum çanı içine yerleştiriyoruz ve içerisine karışmış olan havayı tahliye etmek için hazneyi vakumluyoruz. Gaz giderme işlemi genellikle 30 dakika ile bir saat arasında sürer.

Gaz giderme işleminin ardından, cihazları vakum odasından çıkarıp 65 ile 80 °C arasındaki bir fırına yerleştiriyoruz. Bu sıcaklıklarda minimum kürlenme süresi üç ila altı saattir. Kendi laboratuvarımızda cihazları genellikle gece boyunca fırında bırakıyoruz.

Genellikle 11 numara cerrahi çelik bıçak kullanırız. Silikon kalıbın kenarından yaklaşık yarım santimetre içeriye doğru düz kesikler atarız ve kalıbın kenarları boyunca keserek geniş bir disk oluştururuz. PDMS kalıbını ana kalıptan soyarız ve özellikli yüzeyi yukarı gelecek şekilde temiz bir Petri kabına yerleştiririz.

Serbest bırakılan kalıbı Petri kabından çıkarırız ve bir bıçak veya doğrusal bir ray üzerine monte edilmiş bir bıçak kullanarak bir kesme yüzeyine yerleştiririz. Kalıp üzerinde yer alan cihazları kesitler halinde böleriz. Ardından, her bir kesitlenmiş cihaz, daha ileri işlemler için tekrar Petri kabına yerleştirilir.

Genellikle, cihazlarımızı sıvılarla etkileşime geçirmek için PDMS cihazı üzerinde delikler açarız. Delikleri açmak için kullandığımız cihaz, standart bir 3 mm şırıngadır. 3 mm şırınganın ucunda, küt uçlu bir paslanmaz çelik iğne bulunur.

Paslanmaz çelik iğnenin içinde, iğnenin iç çapına uygun bir tel bulunmaktadır. Bu tel, şırınganın pistonuna bağlıdır. Pistonu geri çekip iğneyi geri çekerek PDMS'e bir delik açabilir veya bir tıpa çıkarabilirsiniz. PDMS cihazını ters çevirin ve pistona bastırarak cihazı dışarı çıkarın.

Delme cihazlarını kullanmanın püf noktası, pistonu mümkün olduğunca dikey tutmak ve delme cihazını hiç döndürmemektir. PDMS'yi deldiğinizde, tüm cihazı, yani tüm PDMS cihazını bir cımbız yardımıyla yukarı kaldırın, ters çevirin ve pistona bastırarak tıpaya ait parçayı dışarı itin. Bu parçayı bir cımbızla tutarak atın.

Ardından pistonu tekrar geri çekin, cihazı yeniden aşağı çevirin ve kesme aparatını çıkarın. Tüm delikleri delene kadar bu işlemi tekrarlayın. Bağlama işlemi için, PDMS cihazlarımızı lam camlarına bağlıyoruz.

Cihazlarımız için, PDMS'yi lamlara geri dönüşümsüz olarak bağlayacağız veya kovalent olarak ekleyeceğiz. Bu işlem, bunları bir plazma külleme cihazına (plasma Asher) yerleştirerek reaktif oksijen plazmasına maruz bırakarak gerçekleştirilir. Bunu yapma adımları, PDMS cihazını alıp plazma külleme cihazının tepsisine yerleştirmektir.

Cihaz özellikleri yukarı bakacak şekilde, herhangi bir standart cam mikroskop lamı kullanabilirsiniz. Cihazımıza uygun olması için biraz daha genişletilmiş, bir buçuk inçlik bir mikroskop lamı kullanıyoruz. Bunları paketinden çıktığı gibi doğrudan kullanabilirsiniz.

Bunları piranha solüsyonu ile işlemeyi tercih ediyoruz. Bu işlem, cam lamın yüzeyinde bulunabilecek tüm organik kontaminantları temizler. Cihazı ve cam lamı plazma külleyici tepsisinin üzerine yerleştirdikten sonra, tepsiyi plazma külleyicinin içine sürerek reaktif oksijen plazmasına maruz bırakırsınız.

Plazma Asher programı tamamlandıktan sonra, hazneyi açıyoruz ve cihazlarımızın bulunduğu plakayı tezgah üzerine alıyoruz. Cımbız kullanarak, yapışma yüzeylerine parmaklarımızla dokunmamaya dikkat ederek PDMS cihazı dikkatlice kaldırıyoruz. Yapışma tarafını cam lamın üzerine kapatıyoruz ve ardından PDMS ile cam lam arasında hava kabarcığı kalmadığından emin oluyoruz.

Daha iyi bir kimyasal bağ elde etmek için, cama bağlanmış PDMS cihazını 10 dakika boyunca 65 ila 75 °C'deki bir sıcak plakaya yerleştiriyoruz. Bu bölümde, temiz odadaki bağlanma işleminin ardından PDMS ve cam yüzeylerini kimyasal olarak modifiye edeceğiz; sonuçta yüzeyde reaktif OH grupları bulunan bir PDMS yüzeyi ile kalırız. Hidrofilik olan bu reaktif yüzeye ihtiyaç duymaktayız ve bu gruplar zamanla PDMS'in gövdesine yayılacaktır.

Yüzey kimyası işlemleri plazma uygulamasının hemen ardından gerçekleştirildiğinde en iyi sonucu verir; bu nedenle %5'lik bir 3-merkaptopropiltrimetoksisilan çözeltisi kullanacağız. Hacimce %5'lik olan bu çözeltiyi giriş kısmından enjekte ediyoruz ve cihazın içinde hiç hava kabarcığı kalmadan tamamen dolduğundan emin oluyoruz.

Herhangi bir hava kabarcığı mevcutsa, bunları cımbızla dışarı itersiniz. Slan'ı enjekte ettikten sonra, oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika bekletirsiniz. Tipik olarak, reaksiyonun 10. dakikasında ikinci bir hacim slan enjekte ederiz.

Silylasyon işlemi yaklaşık yarım saat boyunca devam ettikten sonra, tüm cihazları üç ila dört cihaz hacmi kadar saf etanol ile yıkayacağız. Dışarı attığımız fazla miktarı bir kimyasal temizleme beziyle sileceğiz. Cihazların durulanmasının ardından, cihazları alıp 100 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plakaya yerleştireceğiz ve içindeki etanolün buharlaşmasını sağlayacağız. Bu işlem, silylasyon yüzeyinin ardından kurutulmasına yardımcı olur.

Cihaz kuruduktan sonra, aylarca bir desikatörde saklanabilir veya cihazı alıp hemen bir sonraki adıma geçebilirsiniz. Cihazlar kürlendikten sonra, hem cam hem de PDMS yüzeyinde bir sine kaplaması oluşmuş olur. Sine, hetero bifonksiyonel çapraz bağlayıcımız olan GMBS ile reaksiyona girecek olan tiyol grubu içeren bir kapto sine'dir.

Saf etanol içinde seyreltilmiştir. Suyla reaksiyona girdiğinden, sulu ortamlara maruz kalmamasına dikkat etmeniz gerekir. Cihazların içine enjekte ediyoruz ve tüm yüzeylerin bu molekülle kaplandığından emin olmak için, burada yaptığım gibi, hava kabarcıklarını cımbızla temizliyoruz.

Kapağını kapatıyoruz ve yarım saat boyunca reaksiyona bırakıyoruz. GMBS yarım saat boyunca reaksiyona girdikten sonra, cihazdaki tüm etanol kalıntılarını temizlemek için cihazları deiyonize su ile durulayacağız. Ardından, biotin bağlayıcı protein olan Neutravain akışı sağlayacağız.

Ardından neutravain, mL başına 10 µg konsantrasyona ön seyreltme yapılır. Eğer cihaza yanlışlıkla hava girerse, tüm havayı etkili bir şekilde uzaklaştırmak için cihazın etanolle yeniden yıkanması gerekecektir; etanol, cihaz yüzeylerini daha iyi ıslatarak cihaza yanlışlıkla giren hava kabarcıklarının temizlenmesini sağlar. Cihazlar iyonize su ile yıkandıktan sonra, genellikle cihazı seyreltilmiş neutravain çözeltisinin iki ila dört cihaz hacmi kadarla doldururuz.

Nutt travain, Nutt travain üzerindeki herhangi bir birincil yöntemle yüzeye immobilize edilmiş olan GMBS ile reaksiyona girecektir. Bu işlem oda sıcaklığında bir saat boyunca gerçekleşebilir. Genellikle, cihazları gece boyunca dört °C'de soğuk odaya yerleştiririm.

Ancak, antikoru eklemeden önce, çözeltide bağlanmamış olan tüm Aden'i dışarı atmak istiyoruz. Bunu, PBS içinde seyreltilmiş %1'lik BSA çözeltisi akıtarak yapıyoruz. Bu çipler daha sonra genomik analizler için kullanılacağından, kullandığımız tüm çözeltiler RNA içermez.

Genellikle, cihazı dört ila beş hacim %1BSA çözeltisi ile yıkarız. Bunun ardından antikorumuzu ekleriz. Bu deney için kullanılan antikor, CD 66 B ve tüm kandaki granülositlere özgü antikorlardır.

10 ile 25 µg/mL arasında bir konsantrasyon kullanıyoruz ve ardından antikoru enjekte edeceğiz. Her bir cihaza 200 µL antikor enjekte edeceğiz. Cihazın her bir portuna yüzer microlitre olmak üzere iki enjeksiyon yapacağız.

Genellikle, bir porta 100 µL enjekte ederiz, 30 dakika bekleriz ve karşı porta ek olarak 100 µL daha enjekte ederiz.