Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, zebrafish embriyolarındaki seçili tek hücrelerin kader haritalaması (fate mapping) ve soy takibinin (lineage tracing) gerçekleştirilmesidir. Bu işlem, kafeslenmiş (caged) floreseinle yüksek moleküler ağırlıklı dekstranın kimyasal olarak konjugasyonuyla sağlanır. Ardından, hazırlanan kafeslenmiş floresein dekstran zebrafish embriyolarına mikroenjeksiyonla aktarılır ve daha sonra iki foton absorbsiyonu kullanılarak seçili hücrelerde fotoaktive edilir.

Embriyoların fotoaktivasyonundan sonra, aktive edilen hücrelerin kader haritalamasını yapmak amacıyla kafesten kurtulmuş florisayn dekstranı tespit etmek için immünohistokimyasal analiz gerçekleştirilir. Nihayetinde bu yöntem, fotoaktive edilmiş tek hücrelerin soy hattı katkısını ve doku lokalizasyonunu belirlemek için kullanılabilir. Bu tekniğin standart floresan mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kader haritalaması için tek hücrelerin farklı şekilde etiketlenmesine olanak tanımasıdır.

Bu yöntem, farklılaşmamış öncül hücrelerin farklı doku türlerine nasıl katkıda bulunabildiği gibi gelişimsel biyolojideki temel soruları yanıtlamamıza yardımcı olabilir. Embriyo montajı ve fotoaktivasyon adımlarının yalnızca metin açıklamalarına dayanarak öğrenilmesi zor olduğundan, görsel gösterim kritik öneme sahiptir. Başlamadan önce, kafeslenmiş floresein dekstran sentezleyin ve metal folyo ile kaplı tüplerde saklayın. Ardından, bir ila iki hücre aşamasındaki embriyolara sentezlenen kafeslenmiş floresein dekstranı mikroenjekte edin.

Embriyolar uygun gelişim aşamasına ulaştıktan sonra onları kaplayın. Ardından, fotoaktivasyon için kaplanmış embriyoları düşük erime noktalı agar içerisine yerleştirin. Agar katılaştığında LSM 510 yazılımını yükleyin.

Beyaz ışık demeti yoluna şeffaf sarı bir filtre yerleştirin, ardından yeni görüntü tara (scan new image) seçeneğini belirleyin ve uzman modunu başlat (start expert mode) düğmesine tıklayın. Lazer sekmesini seçin, argon iyonu ve mi tai lazer kaynaklarını açın. Mi tai dalga boyunu 740 nm olarak ayarlayın.

Ardından, config sekmesini seçin. Argon iyonu ve mi tai lazeri için optik yol konfigürasyonlarını ayarlayın. Daha sonra scan sekmesini seçin.

Objektifi 20x 0.8 ile değiştirin. Kanallar (channels) sekmesi altında, sırasıyla "max set mode method" ve "number to line" seçeneklerine tıklayarak maksimum tarama hızını "mean" ve "one" olarak ayarlayın; mi tai dışındaki tüm lazer kaynaklarının seçimini kaldırın. Ardından, optik ışın yoluna bir güç ölçer yerleştirin ve sürekli taramayı etkinleştirmek için "con" düğmesini seçin.

Güç ölçer ortalama 47 milliwatts lazer gücü okuyana kadar iletim yüzdesini ayarlayın. Ardından kanallar sekmesi altındaki durdurma düğmesini seçerek taramayı durdurun. mi tai lazer kaynağının seçimini kaldırın ve argonne iron'u seçin.

Ardından kanallar sekmesi altındaki fast XY düğmesini tekrar seçin, pinhole'u ayarlayın. Argonne demir lazeri ile en iyi görüntü kalitesini elde etmek için detect gain, amplify a offset ve amplify değerlerini yeniden ayarlayın. Sahne kontrol cihazını kullanarak aktive edilecek hücreyi bulun ve odaklayın, ardından durdurma düğmesine tıklayın. Kırpma aracını kullanarak, mod sekmesi altındaki kırpma faktörü 50 ila 70 arasında görünecek şekilde aktive edilmiş hücreyi kırpın.

Ardından, kanallar sekmesindeki durdurma butonunu seçerek taramayı durdurun. Mod sekmesi altından argon iyon lazerinin seçimini kaldırın ve My Tai lazerini seçin. Tarama hızını 31,46 saniye olarak ayarlayın.

Ardından, seçilen hücrenin kafeslenmiş floresein dekstranının iki foton aktivasyonu için taramayı başlatmak üzere tekli düğmeyi seçin. Aktivasyondan sonra, kanallar sekmesine gidin; burada mi tai lazer seçimini kaldırın ve argon iyon lazerini yeniden seçin. Daha sonra mod kısmında, yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın. İleri.

Hız başlığı altındaki max düğmesine tıklayarak en hızlı tarama hızını ayarlayın. Foto-aktive edilen bölgeyi incelemek için fast xy'yi seçin. Ardından kanallar sekmesini seçip iğne deliğini (pinhole) ayarlayın ve tekrar tespit ederek foto-aktive edilen bölgenin lazerle ablate edilmediğini kontrol edin.

Eşlik eden makalede belirtilen protokolü takip ederek, foto-aktive edilmiş embriyoları kafessiz floresein dekstran immün deteksiyonu için hazırladıktan sonra, embriyoları altı kez PBT ile ve iki kez AP tamponu ile yıkayın. Ardından embriyoları, AP tamponu içeren dokuz kuyucuklu plakalara aktarın.

Ardından, AP tamponunu aspire edin ve N-B-T-B-C-I-P ekleyin. N-B-T-B-C-I-P solüsyonunu aspire ederek N-B-T-B-C-I-P boyama gelişimini durdurun. Daha sonra embriyoları PBT ile yıkayın.

Şimdi embriyoları geri alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca döner bir platform üzerinde sallayın. Ardından PBT ile yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, embriyoları %0,6 düşük erime noktalı agar içine yerleştirin ve dik bir bileşik mikroskop kullanarak fotoaktifleşmiş hücrelerin görüntülerini elde edin.

Bu şekilde, foto-aktivasyon öncesinde kafesli fluorescein dekstran zincirinin mikroenjeksiyonu yapılmış bir zebra balığı embriyosunun sol tarafta parlak alan görüntüsü ve sağ tarafta floresan görüntüsü gösterilmektedir. Burada görüldüğü üzere, embriyo; sol taraftaki parlak alan figüründe okla belirtilen somitlerden birinde 740 nm dalga boyu, 31 saniye tarama süresi ve 47 mW ortalama lazer gücü ile foto-aktive edilmiştir. Sağdaki figürde, foto-aktivasyon sonrası kafesi açılmış fluorescein dekstrandan gelen floresan gözlemlenebilmektedir.

Kafes dışı floresein dekstranın immün boyaması, 10 somit evresindeki bir embriyonun lateral plağı, mezoderminin küçük bir bölgesinde gösterilmiştir. Önceki şekildekiyle aynı lazer parametreleri kullanılarak fotoaktivasyon gerçekleştirilmiş ve immün deteksiyon prosedürü uygulanmıştır. Burada okla belirtilen aktive edilmiş bölge, bu prosedürün ardından minimum arka plan boyaması ile tanımlanabilmektedir.

Etiketlenen hücrelerin konumunu ve akıbetini daha iyi karakterize etmek için farklı dokuya özgü belirteçler için immün boyama gibi ek analizler gerçekleştirilebilir. Bu teknik, vasküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, gelişmekte olan zebra balığı embriyolarındaki venöz progenitör hücrelerin arteriyel kökenini incelemelerine yol açmaktadır. NBT ve BCIP gibi kimyasal reaktiflerle çalışırken, bunların son derece tehlikeli olabileceğini ve her zaman eldiven takılması gerektiğini unutmayın.