Blastomer Eksplantlarından Embriyonik gelişim sırasında Hücre Kader Taahhüt Test Etmek için
26 Ocak 2013
Tek bir embriyonik hücre kaderi, kalıtsal molekülleri ve / ya da hücrede gelen sinyalleri tarafından etkilenebilir. Klivaj dönemi Xenopus embriyosunun kaderi haritaları kullanarak, tek blastomer hücre-hücre etkileşimleri karşı kalıtsal molekül katkıları değerlendirmek için izole kültür için tespit edilebilir.
Bu videoda gösterilen yöntem, embriyonik belirlemenin içsel mi yoksa dışsal talimatlar tarafından mı belirlendiğini değerlendirmek amacıyla, tek bir blastomerin izole bir şekilde kültürlenmesini sağlamak için bölünme aşamasındaki deniz kestanesi embriyosunun kader haritalarından yararlanır; öncelikle, ilk bölünme oluğunun hayvan yarımküresindeki hafifçe pigmentli alanı ikiye böldüğü iki hücreli embriyolar toplanır. Bu embriyolar kültürlenir ve embriyolar 16 ila 32 hücreye ulaştığında, vitellin membran uzaklaştırılır ve komşu hücreler seçilen hücreden diseke edilerek ayrılır. Açıklama için, diseke edilen blastomer daha sonra agar kaplı bir kültür kuyucuğundaki bir çukura aktarılır ve kültürlenir.
Eksplant istenen aşamaya ulaştığında, in situ hibridizasyon, QPCR veya immünohistokimya kullanarak gen veya protein ekspresyonunu değerlendirmek için hasat edilir. Bu tekniğin kültürleme, büyük embriyonik hücre grupları veya organoidler gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, soy takibi çalışmalarıyla gelişimsel kaderi bilinen tekil embriyonik blastomerlerin, ek büyüme faktörleri veya komşu hücrelerin varlığı olmadan kültüre edilebilmesidir. Böylece, hücrenin kendisine özgü faktörlerin o blastomeri belirli bir dokunun öncüsü olmaya yönlendirip yönlendirmediği veya çevre hücrelerden gelen sinyallere ihtiyaç duyup duymadığı doğrudan test edilebilir.
Blastomerlerin diseksiyonu ve kültür kuyucuklarına transferi, stereo mikroskop altında hassas manipülasyonlar gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu videoda, maternal kaynaklı mRNA'ların hücreleri nöral bir kadere yönlendirip yönlendirmediğini göstermek için bu yöntemi kullanacağım. Diseksiyon mikroskobu altında çalışın. Illumina aşındırıcı film kullanarak dört set pensi kesinleştirin.
Prosedür sırasında bir ucun hasar görmesi ihtimaline karşı bir pens çifti yedek olarak kullanılır; dört pensi de otoklavlayın ve steril bir kapta saklayın. Modifiye Barth salin veya MBS'nin 0.1 x ve 1.0 x konsantrasyonlarından 500 mililitre씩 hazırlayın ve filtre ile sterilize edin. Bu çözeltileri cam vidalı kapaklı şişelerde, 14 ila 18 santigrat derece sıcaklıkta aylarca saklayın. 100 mililitre 1 X kültür ortamında %2 elektroforez dereceli agar hazırlayın; agarı çözmek için otoklavlayın. Agar tekrar gerektiğinde, sıvı haldeyken sıvılaştırmak için mikrodalga fırın kullanın.
Steril bir 24 kuyucuklu kültür plağının her bir kuyusunun dibine yaklaşık 0.5 milliliters dökün. Bu, implantların plastiğe yapışmasını önleyecektir. Ardından, iki adet 360 millimeter Petri kabının dibine yaklaşık iki ila üç milliliters dökün ve dağıtmak için nazikçe çalkalayın.
Bunlar diseksiyon kapları olarak hizmet edecek ve aros embriyoların plastiğe yapışmasını önleyecektir. Membranları çıkarıldıktan ve aros soğuyup sertleştikten sonra, altı inçlik bir pastör pipetinin ucunu bir top haline gelene kadar alevle ısıtın. Topu kısa bir süre tekrar ısıtın, ardından kültür plağındaki bir kuyucuğun içindeki aros yüzeyine hafifçe dokundurun.
Bu işlem, X explanın yerleştirileceği sığ bir çöküntü oluşturacaktır. Plakadaki her bir kuyucuk için işlemi tekrarlayın. Ardından, kültür plağının her bir kuyucuğunu bir mililitre 1x steril kültür ortamı ile doldurun.
Ardından, blastomer ayrılmasını kolaylaştırmak için diseksiyon kabını 0.1 XMBS ile doldurun. Diseksiyon kapları hazırlandıktan sonra, jöle tabakaları uzaklaştırılmış döllenmiş yumurtaları 0.5 x kültür ortamı içeren 100 milimetrelik Petri kaplarına aktarın. Hemen kullanılmayanlar, ilk kap iki hücreli embriyolar için incelenirken 14 degrees Celsius'de kültüre edilebilir.
İlk Petri kabındaki embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve plastik bir transfer pipeti kullanarak yaklaşık 10 tane tek hücreli ve iki hücreli embriyoyu, 0.5 x kültür ortamı ile doldurulmuş ayrı bir kaba aktarın. Petri kabını 14 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bu analiz yönteminin bir hücrenin gelişim potansiyelini doğru şekilde değerlendirme yeteneği, kader haritalarına dayanarak doğru blastomerin diseksiyonla ayrılmasına bağlıdır.
Bu nedenle, iki hücreli evrede, normal bölünme kalıplarına uygun olan doğru pigmentasyon paternine sahip embriyoların seçilmesi kritik öneme sahiptir. Burada gösterildiği üzere, normal bölünmeler genellikle embriyonun sadece bir tarafında meydana gelir.
Donör hücre normal taraftan geliyorsa, bu embriyolar hâlâ donör olarak kullanılabilir. Embriyolar iki hücreli aşamaya geldiğinde, ilk bölünme oluğunun hayvan yarımküresindeki hafif pigmentli alanı ikiye böldüğü embriyoları ayrı bir kaba ayırın; diseke edilecek embriyo sayısının yaklaşık beş katı kadar embriyo ayırın. Bunlar, eksplan için donörler olacaktır.
Ekspanın evresini belirlemek için kardeş kontrolleri olarak hizmet edecek kalan iki hücreli iki embriyoyu, işlem boyunca donör embriyoların yanındaki ayrı bir kapta tutun. Embriyolar ayrıştırılıp diseke edildikten sonra, daha fazla tek hücreli ve iki hücreli embriyo bulmak için inkübatördeki kaplara geri dönün. Tek hücreli embriyoların bölünmesi yaklaşık 90 dakika sürdüğünden, bu işlem yumurta toplamasından sonra iki saate kadar yapılabilir.
Ekspanı hazırlamak için beş ila 10 embriyoyu bir diseksiyon kabına yerleştirin. Ardından, şeffaf vitelin membranın pensle tutulabileceği şekilde ilk embriyoyu konumlandırın. Bu membran genellikle görülemez, ancak embriyonun yüzeyinin üzerinde belirgin bir peral boşlukla ayrıldığı animal kutupta tutulabilir.
Bir elinizde bulunan sivri uçlu pensle, diseke edilecek blastostere zarar vermemek için ondan belli bir mesafeden kavrayın. Ardından, diğer elinizdeki sivri uçlu pensle, diğer pensin ucuna yakın bölgedeki membranı tutun ve membranı soyarak ayırmak için nazikçe zıt yönlere doğru çekin. Membran kaldırıldığında embriyo düzleşecektir.
Ardından, pensle komşu bir hücreyi yakalayın ve diseke edilecek hücreye diğer eldeki pensle doğrudan dokunmamak için bu hücreyi bir tutamak olarak kullanın; kalan komşu hücreleri istenen blastomerden nazikçe uzaklaştırın. Aynı kadere sahip olan orta hat hücreleri hedefleniyorsa, bunlar bir çift olarak birlikte çıkarılabilir. Son olarak, tutamak hücreyi diseke ederek ayırın.
Hava kabarcıklarından ve aşırı vakumdan kaçınarak, steril bir cam pastör pipeti ile blastomer veya embriyo çiftini alın. Pastör pipetinin ucunu, X açıklıklı kültür kabının bir kuyucuğundaki kültür ortamının yüzeyinin altına yerleştirin ve blastomeri nazikçe boşaltın. Blastomer, yer çekimi yardımıyla sığ çukura doğru kaymalıdır.
Birden fazla embriyodan elde edilen blastomerler, bir kültürdeki aynı çukura yerleştirilerek tek bir eksplan haline getirilebilir. Bu prosedür, diseksiyon kabındaki geri kalan embriyolarla tek tek tekrarlanır. Yaklaşık 10 embriyodan sonra, diseksiyon kabı hücresel döküntülerle dolacaktır.
Bu durum gerçekleştiğinde, bir sonraki diseksiyon kabına geçiniz. Tüm diseksiyonlar tamamlandıktan sonra, eksplanların sığ çukurlarda olup olmadığını kontrol ediniz. Eğer değillerse, %70 Ethanol ile sterilize edilmiş ve havada kurutulmuş bir saç döngüsü (hair loop) ile nazikçe çukura itilebilirler; implantları son diseksiyondan yaklaşık bir saat sonra tezgah üzerinde oda sıcaklığında inkübe ediniz.
İyileşmiş eksplantın etrafındaki döküntüleri steril bir cam pastör pipeti ile temizleyin. Eksplantın bulunduğu plakayı, kardeş kontrol embriyolarını içeren Petri kabının yanına, 14 ila 20 °C sıcaklığa yerleştirin. Kardeş embriyolar, blastem eksplantın gelişim aşamasını belirleyecektir.
Kültürde yaklaşık bir ila iki saat geçtikten sonra, ekislenmiş blastomerler yaklaşık dört kez bölünmüş olacak ve hasarlı komşu hücrelerden kalan kalıntıların çoğunu uzaklaştırmış olacaktır. 20 saat sonra, küçük ve dayanıklı hücre topları oluştururlar. Kardeş hücreler istenen gelişim evresine ulaştığında, eksplantı hasat edin.
Bazı hücreler parçalansa bile, bu eksplantlar oldukça iyi bir şekilde hayatta kalırlar. Bu nedenle, kültürde bulanık bir kütle varsa, içinde sağlıklı bir eksplantın gömülü olup olmadığını belirlemek için bir öze veya pensle bu kütleyi inceleyin. Eksplantı, cam pastör pipetiyle küçük bir hacimdeki kültür solüsyonuyla alın ve gerçekleştirilecek analize uygun bir fiksatif veya lizis tamponuna nazikçe aktarın.
İki dorsal blasphemer veya iki ventral blasphemer 16 hücreli evrede diseke edildi ve kardeş embriyolar erken nöral plaka evrelerine ulaşana kadar 14 °C'de bir XMBS içerisinde kültüre edildi. Her örnek, mavi reaksiyon ürünü olarak görülen in situ hibridizasyon yöntemiyle zigotik nöral plaka geni Sox two ekspresyonu açısından analiz edildi.
Bu analizin sonuçları, nöral plakanın öncülleri olan dorsal hayvan blastomerlerinin çoğunluğunun, SOX2'yi otonom olarak eksprese edebildiğini göstermektedir. Yani, embriyonun diğer bölgelerinden gelen ek sinyalleşme olmaksızın bu ekspresyon gerçekleşebilmektedir. SOX2 eksprese etmeyen blastomerler, diseksiyon sırasında yanlış tanımlanmış olabilir.
Buna karşılık, ventral epidermisin öncülleri olan ventral animal blastomerlerin hiçbirinde SOX2 eksprese edilmemiştir. Bu veriler, dorsal animal blastomerlerin nöral doku oluşturma konusunda içsel bir yeteneğe sahip olduğunu, ventral animal blastomerlerin ise sahip olmadığını göstermektedir. Bazı dorsal blastomerler ayrıca dorsal mezoderm oluşumuna işaret eden uzamış bir morfoloji sergilemiştir.
Bu blastomerler aynı zamanda sağlam embriyoda nöral dokuyu oluşturacak şekilde belirlenmiştir ve maternal olarak eksprese edilen nöral bir genin endojen seviyelerini değiştirmenin etkisini test etmek için bir explan kültürü nöral belirteç proteini eksprese eder. Fox D beş mRNA'ları, sekiz hücreli ventral öncül blastomerlere enjekte edilmiştir. Burada gösterildiği gibi, ventral implantların çoğunluğu SOX iki eksprese etmiştir.
Aksine, sekiz hücreli dorsal öncül blastomerlere antisense morfolino oligonükleotidlerin enjekte edilmesiyle endojen Fox D5 seviyesi düşürüldüğünde, yalnızca birkaç dorsal blastomer SOX2 eksprese etmiştir. Bu deneyler, maternal Fox D5 ekspresyonunun, dorsal blastomerlerin nöral bir kader edinme konusundaki intrinsik yeteneğinde rol oynadığını göstermektedir. Bu prosedürden önce, ek soruları yanıtlamak için fonksiyon kazanımı için mRNA'ların veya fonksiyon kaybı için antisense morfolino oligonükleotidlerin disseke edilecek blastomerlere enjekte edilmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir.
Örneğin, hücrelerin belirli bir gelişimsel kadere yol açma konusundaki içsel yeteneklerinde hangi genler rol oynamaktadır? Ek olarak, kültür ortamına saflaştırılmış faktörler ekleyerek bilinen sinyal faktörleri test edilebilir. Bu yaklaşım, tekil blastomerlerin sağlam embriyodaki yeni konumlara nakledilmesi için de kullanılabilir.
Bu test, nakledilen hücrenin orijinal gelişimsel kaderine bağlı olup olmadığını belirler; bu bilgi, pluripotent bir embriyonik hücrenin belirli bir dokunun öncüsü olmaya yönelmesini sağlayan hücresel mekanizmaların tanımlanması açısından kritik öneme sahiptir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, bölünmeye başlayan Xenopus embriyosunda embriyonik hücrelerin kaderinin, kalıtsal moleküller ve hücre-hücre etkileşimleri tarafından nasıl etkilendiğini araştırmaktadır. Araştırmacılar, kader haritalarını kullanarak, içsel ve dışsal faktörlerin katkılarını ayırt etmek için tek tek blastomerleri izole olarak kültür edebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Hücre Biyolojisi
- Embriyoloji
Arka Plan
- Embriyonik hücre kaderi hem kalıtsal moleküller hem de komşu hücrelerden gelen sinyaller tarafından etkilenebilir.
- Bu etkileri anlamak gelişimsel biyoloji için çok önemlidir.
- Xenopus embriyoları erken gelişimsel süreçleri incelemek için bir model olarak kullanılır.
- Kader haritaları, hücre soyunu ve kader belirlenmesini görsel olarak temsil eder.
Çalışmanın Amacı
- Embriyonik hücrelerin kaderinin içsel faktörler veya dışsal sinyaller tarafından belirlendiğini değerlendirmek.
- Detaylı analiz için tek tek blastomerleri izole olarak kültür etmek.
- Gelişimsel sonuçları tanımlamak için soy izleme çalışmalarını kullanmak.
Kullanılan Yöntemler
- İki hücreli aşamada Xenopus embriyolarının toplanması.
- Seçilen blastomerlerden komşu hücrelerin ayrılması.
- İzole edilmiş blastomerlerin kontrollü bir ortamda kültür edilmesi.
- İn situ hibridizasyon ve QPCR gibi tekniklerle gen veya protein ekspresyonunun değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Tek tek blastomerler, komşu hücrelerin etkisi olmadan kültür edilebilir.
- Çalışma, hücre kader belirlenmesinde içsel ve dışsal faktörlere dair görüşler sunar.
- Gen ve protein ekspresyon analizleri, izole edilmiş hücrelerin gelişimsel potansiyelini ortaya koyar.
Sonuçlar
- Embriyonik hücrelerdeki içsel faktörler, gelişimsel kaderlerinde önemli bir rol oynar.
- Komşu hücrelerden gelen dışsal sinyaller de önemlidir ancak çalışma için izole edilebilir.
- Bu yöntem, hücre kader belirlenme mekanizmalarını daha net bir şekilde anlamamızı sağlar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct testing of intrinsic versus extrinsic factors in cell fate determination, providing mechanistic de-risking for target validation in developmental pathways. By isolating single blastomeres with known lineage, it supports predictive confidence in early discovery by clarifying whether cellular responses are cell-autonomous or dependent on microenvironmental cues. This approach aids in distinguishing true target engagement from indirect effects, improving go/no-go decisions in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by testing whether a cell’s fate is fixed or influenced by extrinsic signals, informing target autonomy.
- Operational Value: Uses fate maps to identify and isolate single precursors with known developmental potential, enabling precise experimental design.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening readiness by establishing baseline autonomous behavior in a controlled, neighbor-free system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, single-cell resolution readouts (e.g., SOX2 expression via in situ hybridization or qPCR) for pathway-specific reporter assays.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture of isolated blastomeres in defined media without exogenous factors, reducing variability.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats, allowing parallel testing of multiple conditions or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links early fate commitment mechanisms to later tissue formation, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes require cell-cell communication, helping de-risk targets dependent on niche signaling.
- Predictive Confidence: Distinguishes cell-autonomous drivers from non-autonomous effects, improving target selection for modulation strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, particularly for pathways where cellular context influences phenotype expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating variables to determine if a target’s effect is intrinsic or requires intercellular signaling.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs (e.g., marker gene expression) suitable for high-content or multiplexed assay formats.
- Analytics: Enables statistical comparison of fate outcomes across conditions, supporting replication and cross-functional data interpretation.
- Translational Research: Connects early embryonic decisions to later developmental stages, aiding in disease-relevant system modeling when lineage conservation exists.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing genetic or pharmacological perturbations in a defined, isolated cellular context.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating intrinsic cellular properties from extrinsic microenvironmental influences.
- Operational Value: Promotes standardization through defined dissection, culture, and readout procedures, enhancing reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose efficacy depends on cell-autonomous function.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by clarifying whether a target’s modulation requires combination with microenvironment-modulating agents.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and fluorescence- or marker-guided cell identification using fate maps.
- Dependent on sterile culture infrastructure, including controlled-temperature incubators and precision pipetting tools for blastomere transfer.
- Necessitates standardization of culture conditions (e.g., MBS concentration, temperature) to ensure comparability across experiments.
- Must account for variability in embryo quality and cleavage symmetry when selecting donor cells for isolation.
- Limited to species with well-established fate maps and ex utero culture feasibility (e.g., Xenopus), restricting direct translation to mammalian systems without adaptation.
