Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

Aşağıdaki kesim yükleme deneyinin genel amacı, kontrollü aydınlatma koşulları altında, sağlam retina üzerindeki nöronlar arasındaki gap junction (boşluk bağlantısı) izleyici eşleşmesinin derecesini incelemektir. İlk adım, retinaların; açık gap junction kanallarından difüze olabilen ancak hücre membranlarından geçemeyen bir izleyici molekül olan nörobiyotin çözeltisine batırılmış keskin bir bıçakla kesilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda retinalar, izleyicinin açık gap junction kanallarından difüzyonuna izin veren Ringer çözeltisinde inkübe edilir.

Gap junction kenetlenmesi zayıfsa, nörobiyotin floresansı kesiğe yakın olan retinal nöronlarla sınırlı kalacaktır. Buna karşılık, gap junction kenetlenmesi güçlüyse, floresans kesikten uzaktaki retinal nöronlarda da tespit edilecektir. Kesi yoluyla yüklemenin mevcut tekniklere göre temel avantajı, sağlam nöral retinal dokudaki küçük hücre gövdeli nöronlarda uygulanmasının daha kolay olmasıdır.

Ayrıca, kesit yükleme sırasındaki aydınlatma koşullarını kontrol etmek, sağlam retinal dokudaki tekil nöronların elektrofizyolojik çalışmasına kıyasla daha kolaydır. Elektriksel kayıt sırasında kullanılan ışık uyaranlarının kendileri gap junction kenetlenmesinde değişikliklere yol açabildiğinden, tekniği laboratuvarımdan bir doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Chu Choi uygulamaktadır. Bu prosedürde, bir japon balığı cerrahi işlemden önce gündüz vakti en az bir saat boyunca sürekli karanlıkta tutulur ve retinal doku fikse edilene kadar takip eden tüm adımlar da gündüz vakti sürekli karanlıkta gerçekleştirilir; akvaryum suyuna litre başına 150 miligram metan sülfonat ekleyerek japon balığı derin şekilde anestezi edilir.

Ardından, federal ve üniversite kılavuzlarına uygun olarak japon balığını sakrifiye edin ve göz kürelerini dikkatlice çıkarın. Sonra, her bir göz küresinin anterior kısmını uzaklaştırın. Daha sonra, gözün posterior kısmının üzerine bir parça filtre kağıdı yerleştirin ve filtre kağıdı gözün posterior kısmının altında kalacak şekilde filtre kağıdını ve gözü ters çevirin.

Şimdi, karanlığa adapte edilmiş japon balığının sklera ve pigment epitelyumunu içeren göz arka kısmını nazikçe çıkarın. Optik siniri ince uçlu bir makasla kesin. Gözün arka kısmından sağlam nöral retina diseksiyonu yapıldıktan sonra, fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirilen nöral retina, enükleasyon öncesinde filtre kağıda sabitlenmelidir; bu sırada balık, altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna eklenen, test ilacı içeren veya içermeyen 5 mL karbonat bazlı ringer çözeltisi ile oksijenlendirilmiş ortamda anestezi altında tutulmalıdır.

Retinaları sürekli karanlık ortamda kuyucuklara aktarın. Ardından kuyucukları paraform ile mühürleyin ve dokuyu 30 dakika boyunca inkübe edin. Retinayı kesmeden hemen önce, %0,5 neuro biotin'i ringer solüsyonunda çözerek 100 µL izleyici solüsyon hazırlayın.

Ardından, neuro biotin solüsyonunu cam bir petri kabına ekleyin. Daha sonra, retinanın bağlı olduğu filtre kağıdını bir kağıt havlu üzerine hafifçe vurun. Fazla ringers çözeltisini uzaklaştırmak için, bir jilet ucunu neuro biotin solüsyonuna batırın ve retina ile filtre kağıdı boyunca dik bir radyal kesik oluşturun.

Ardından, jilet ucunu tekrar nöro biotin çözeltisine daldırın ve retinayı ikinci kez kesin. Bu işlemi retina başına dört kese kadar tekrarlayın. Bu aşamada, yüklenme ve difüzyona izin vermek için retinayı 15 dakika boyunca test ilacı içeren veya içermeyen taze Ringer ortamına aktarın.

Retinayı, her biri beş dakika sürecek şekilde, test ilacı içeren veya içermeyen taze Ringer ortamı ile üç kez yıkayın. Ardından retinayı, oda sıcaklığında bir saat boyunca 0,1 molar fosfat tampon çözeltisi içindeki %4 paraformaldehit ile fikse edin. Sonrasında retinayı, buzdolabına yerleştirerek dört santigrat derecede gece boyunca 0,1 molar PBS ile yıkayın ve ertesi gün çıkarın.

Retinayı, 0.1 molar PBS ve 0.3% Triton X 100 içerisinde, nihai konsantrasyonu 10 micrograms per milliliter olacak şekilde %2 streptavidin Alexa 4 88 ile reaksiyona sokun ve dört degrees Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, retinayı oda sıcaklığında, her seferinde 10 dakika boyunca üç kez 0.1 molar PBS ile yıkayın.

Retinayı PBS içerisinde filtre kağıdından ayırın. Ardından ince bir fırça kullanarak, retinayı fotoreseptör tarafı yukarı gelecek şekilde vector shield montaj medyumu ile bir lama monte edin. Lamı bir lazer taramalı konfokal mikroskoba aktarın ve farklı deneysel koşulların gap fonksiyonel izleyici kenetlenme derecesi üzerindeki etkilerinin karşılaştırmaları yapılabilmesi için her deneysel koşul için aynı büyütme çözünürlüğü ve ayarlarda fotoğraflar çekin.

Burada, sabit karanlıkta gündüz saatlerindeki fotoreseptör hücre takipçisi eşleşmesinin kapsamı, seçici bir dopamin D2 reseptör antagonistinin varlığında sabit karanlıkta gündüz saatleri ile karşılaştırılmıştır. Her iki görüntüde de jilet kesiğinin solda olduğuna dikkat edin. Tek bir görüntü işaretli hücrelerin tamamını içerebilse de, ilgi duyulan bölgenin bir Z yığınının toplanması ve gösterilen tek bir görüntüye dönüştürülmesi önerilir.

Bu tür bir Zack boyunca ardışık olarak ilerledikçe fotoreseptör hücre izleyici kuplajının kapsamı burada görülmektedir. Bu görüntüdeki jilet kesiğinin sağ tarafta olduğuna dikkat edin. LSM görüntü tarayıcısındaki izleyici kuplajı kapsamını nicelleştirmek için görüntüyü açın, ardından dışa aktar'a tıklayın ve resmi sıkıştırılmamış 16 bitlik bir TIF dosyası olarak kaydedin; ölçek çubuğu, NIH Image J yazılımı kullanılarak bu TIFF görüntüsüne dahil edilmelidir.

Delik montajlı retinaların düşük büyütmeli görüntülerinden Alexa 4 88 ile işaretlenmiş nörobiyotin floresan yoğunluğunu ölçün. Image J yazılımını kullanarak TIFF dosyasını açın ve ardından ölçek çubuğuna karşılık gelen düz bir çizgi çizin. Sonrasında, analyze menüsünden set scale seçeneğine gidin ve bilinen mesafeyi ve uzunluk birimini girin.

Ardından tamam'a tıklayın. Artık floresan ölçümleri milimetre gibi kalibre edilmiş birimlerle sunulabilir. Bunun ardından, dikdörtgen seçim aracını kullanarak ilgilenilen alanı seçin.

Floresan piki, seçiminizin sol sınırına konumlandırılmalıdır. Sağ sınır yakınında floresan sinyali olmadığından emin olun. Sabit karanlıkta elde edilen gündüz kontrol verileri için analyze and plot profile seçeneğine tıklayın.

Soldan sağa doğru eksponansiyel azalma gösteren bir eğri görüntülenmektedir. Ardından açılır pencerede kopyala (copy) seçeneğine tıklayın ve bunu Excel'e yapıştırın. Şu an, biri kesim noktasından olan uzaklığı, diğeri ise floresan yoğunluğunu kesim noktasından olan uzaklığın bir fonksiyonu olarak gösteren iki sütun bulunmaktadır.

Kıyaslama amacıyla, yukarıdaki adımlar gündüz vakti sürekli karanlıkta elde edilen verilerle tekrarlanır. spit bro varlığında, bağıl floresan yoğunluğunu elde etmek için her bir ham floresan değerini maksimum floresan değerine bölün. Kesim noktasına olan mesafe ve bağıl floresan yoğunluğuna karşılık gelen iki sütunu kopyalayın ve ardından bunları origin yazılımına yapıştırın.

Bu adımlar hem gündüz kontrolü hem de gündüz tükürüğü için gösterilmiştir. Bu noktadaki çalışma verilerini, eksponansiyel azalma bir numaralı fonksiyonu ile uydurun; farklı deneysel koşullardaki uzay sabiti değerlerini bir T-testi veya Inova kullanarak karşılaştırın.

Karşılaştırma amacıyla gündüz kontrol, gündüz pip rone ve gece kontrol verilerinin eksponansiyel fonksiyonları ve istatistiksel analizleri gösterilmektedir. Burada; kesim yükleme tekniği ile ortaya konduğu üzere, karanlığa adapte edilmiş Japon balığı retinasındaki fotoreseptör hücre izleyici eşleşmesinin gündüz A, gece B ve gündüz seçici bir dopamin D iki reseptör antagonisti olan one varlığındaki durumuna dair örneklere yer verilmiştir. Tüm konfokal görüntüler, karşılaştırma yapabilmek için aynı ayarlar kullanılarak alınmıştır.

Bu grafikte, üç farklı deneysel koşul için floresans yoğunluğu, kesim noktasından olan uzaklığın bir fonksiyonu olarak çizilmiş ve eksponansiyel fonksiyon ile fit edilmiştir. Burada üç deneysel koşul için gösterildiği gibi, uzay sabiti değerleri hesaplanarak gap junctional tracer eşleşmesinin derecesini belirlemek için kesim yükleme tekniği kullanılmıştır. Kesim yükleme tekniği, retinadaki diğer hücre tipleri arasındaki veya diğer türlerdeki elektriksel sinapsları incelemek için de kullanılabilir.

Örneğin, bu iki şekil, tavşandaki A tipi ve B tipi yatay hücrelerin, karanlığa adapte edilmiş koşullar altında kesme yüklemesi ve nörobiyotin difüzyonunun ardından homolog izleyici eşleşmesi sergilediğini göstermektedir. Çubuk ve koni hücreleri arasındaki gap junction'lar aracılığıyla izleyici difüzyonunun gece ve gündüz gerçekleşme derecesini incelemek için kesme yüklemesi tekniğini kullandık. Ayrıca bu teknik, diğer retinal nöronlar arasındaki izleyici eşleşmesinin retinal saat tarafından ve/veya spesifik ışık-karanlık koşulları tarafından kontrol edilip edilmediğini belirlemek için kullanılabilir.

Ayrıca, diğer beyin bölgelerindeki nöronlar arasındaki izleyici eşleşmesini incelemek için de kullanılabilir.