GFP-Aktin ifade Canlı Endotel Hücreleri Aktin Sitoiskelet Çalışması

Bu prosedürün amacı, canlı endotel hücrelerin aktin sitoskeletindeki dinamik değişimleri gözlemlemektir. Öncelikle, insan göbek kordonu ven endotel hücrelerini A GFP beta actin plazmidi ile transfekte edin ve lameller üzerinde konfluens olana kadar kültüre edin. Ardından, lamelleri ısıtmalı bir sahneye ve albumin fizyolojik tuz çözeltisi infüzyonuna sahip bir canlı hücre görüntüleme haznesine yerleştirin.

Son adım, farmakolojik bir ajanla tedavi öncesi ve sonrası zaman ayarlı görüntü yakalama yoluyla seçilen bir hücre alanının veri kazanımıdır. Image J gibi görüntüleme yazılımlarıyla yapılan Chime grafik analizi; çıkıntıların mesafe, süre ve hız gibi yerel lamelipodia çıkıntılarına dair bilgilerin yanı sıra zaman içindeki aktin lifi hareketine ilişkin veriler sağlayabilir. Bu tekniğin immunofloresan görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı hücre görüntülemenin, aktin ve hücre iskeletinin dinamik doğasının endotel geçirgenliğini belirleyen mekanizmalara ilişkin çalışmalara dahil edilmesine olanak tanımasıdır.

Sabitlenmiş boyalı hücreler zamandaki anlık görüntüleri temsil ederken, inflamatuar bir mediyatörle işlem öncesi ve sonrasındaki eylem ve hücre iskeleti dinamikleri hakkında düşük düzeyde bilgi sağlarlar. Biyolojik güvenlik kabininde, lamelleri %70 ethanol ile iki dakika boyunca sterilize edin ve ardından havada kurumaya bırakın. Her bir lamelin 10 santimetrelik bir kültür plağına yerleştirin ve lamel kenarlarına temas etmeden merkezine 300 microliter ılık jelatin çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra sıvıyı aspire edin.

Şimdi, konfluen durumdaki insan göbek bağı ven endotel hücrelerini veya VE'yi %0,25 tripsin EDTA ile hasat edin. Hücreleri sayın ve santrifüj yoluyla doldurun. VE nükleer efektör kiti ile yapılacak bir transfeksiyon reaksiyonu için süpernatant medyanın mümkün olduğunca fazlasını aspire edin.

Hücre peletlerini temel nükleer efektör çözeltisinde tekrar süspande edin ve 0,2 ile 2 µg arasında GFP beta aktin vektör plazmidi ekleyin. Hücre süspansiyonundan 100 µL'yi bir nükleer efektör qve'ye aktarın. Q vet tabanı ile transfeksiyon örneği arasında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için kapağı kapalı vete'ye birkaç kez hafifçe vurun.

Q VET'i nükleer efektör iki cihazına yerleştirin ve nükleer efektör kitinden bir transfer pipeti kullanarak, 500 µL ısıtılmış EGM iki MV medyumu qve'ye ekleyerek A 0 3 4 programını çalıştırın. Ardından karışımı tekrar mikrofüj tüpüne aktarın ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Transfekte edilmiş VE süspansiyonunu nazikçe bir kez karıştırın ve kenarlara değdirmeden 300 µL süspansiyonu jelatin kaplı bir lameli üzerine ekleyin.

Ardından bir ila dört saat boyunca inkübe edin. Transfekte edilen hücrelerin lam üzerine tutunduğunu doğrulamak için kontrol edin. Sonra plağa 10 mililitre E GM two MV medyumu ekleyin ve GFP ekspresyonu için inkübasyona devam edin.

İlk olarak, yer çekimi akış sistemine bir albümin fizyolojik tuz solüsyonu ortamı veya bir PSS ekleyin ve hat içi ısıtıcıya bağlayın. Şimdi, yaklaşık 40 mililitre/saat'lik bir akış sağlamak için akış düzenleyiciyi ayarlayın. Ardından, pamuk uçlu bir aplikatör ile musluğu kapatarak akışı durdurun.

Elmas banyosunun alt kısmındaki dış kenara vakum gresi uygulayın. Şimdi inkübatörden transfekte edilmiş bir kültürü çıkarın. Lamellenin üzerini pens yardımıyla nazikçe kaldırın.

Ardından, hücrelerin yüzü yukarı bakacak şekilde konumlandırılmış olan alt lamdaki fazla EGM two MV ortamını bir Kim wipe ile emdirin. Bir hazne oluşturmak için ön camın üzerine elmas banyosunu yerleştirin. Hazneyi hızlıca sahne ısıtıcısına yerleştirin.

Hazne üzerindeki klempleri sıkın ve plaktan hazneye yaklaşık 1 mL EGM two MV medyumu pipetleyin. Şimdi vakum hortumunu haznenin sol tarafındaki tutucusuna ve hat içi ısıtıcıdan gelen A PSS hattını haznenin sağ tarafındaki kanala bağlayın. Ardından, transfekte edilmiş hücreler üzerinde banyo perfüzyonunu sağlamak için vakumu açın ve A PSS hattını aktif hale getirin.

Ayrıca, hat içi ısıtıcıyı 37 °C'ye ayarlayarak açın. Ardından, ısıtmalı tabla için termistör probunu banyonun kenarına yerleştirin ve tabla ısıtıcısını 37 °C'de çalıştırın. Kalan EGM-2 MV besiyeri ve tuz birikintilerini temizlemek için, lamelin alt kısmını %70 etanol ile ıslatılmış bir Kim wipe ile dikkatlice silin ve ardından kuru bir Kim wipe ile kurulayın; transfekte edilmiş HU hücrelerini 30 dakika boyunca dengeleyin.

Kursu kilitleyin. Çalışma için seçilen kültür hücreleri alanına odaklanın. Kamera pozlama süresini, hücrelerdeki GFP Act in sinyal yoğunluğuna bağlı olarak 0.5 ile iki saniye arasında ayarlayın.

Ayrıca deney için aralık ve süre zamanlarını ayarlayın. Şimdi oda ışıkları kapalıyken, ayarları değerlendirmek için tek bir görüntü yakalayın. Görüntüleri ihtiyaç duyulduğunda izleyerek zaman atlamalı seriyi yakalayın.

Tipik bir protokolde, bir test ajanı eklemeden önce 20 ila 30 dakikalık bazal görüntüler elde edin ve ardından 0,5 ila dört saatlik ek görüntüleme gerçekleştirin. Son olarak, beraberindeki metinde detaylandırıldığı üzere, lameli podia çıkıntı mesafesini, kalıcılığını ve hızını CH grafik analizi ile değerlendirin. Tipik bir deneyde, GFP aktin, transfekte edilen VE'lerin %50'sinden fazlasında rastgele bir şekilde eksprese edilir.

Dakikada bir kez alınan bu görüntüler, sitoplazma genelindeki GFP aktinin yanı sıra filamentöz yapılar ve hücre kenarı boyunca uzanan yerel e meli podiaları yakalamıştır. Hücre çıkıntılarının mesafe kalıcılığı ve hızı, zaman serisi görüntü setlerinden nicelleştirilmiştir. Chm grafik analizi kullanılarak, öncelikle hücre kenarına kabaca dik bir tek piksellik çizgi çizilir.

Bu bölge, zamanla değişen bölgenin bir montajını veya burada görülen chime grafiğini oluşturmak için zaman geçimli setin her bir görüntüsünden çıkarılır; chime grafiğinde soldan sağa bakıldığında, uzantılar hücre kenarındaki yukarı yönlü hareketler olarak temsil edilir. Bu uzantılardan birinin kenarına bir çizgi bindirildiğinde, uzantı dinamiklerini nicelleştirmek için o çizgiyle ilişkili piksel verileri toplanabilir. Bir chime grafiğindeki toplam uzantı sayısı, uzantı frekansını tahmin etmek için kullanılabilir.

Bu analiz, hücre çevresinde oluşan ve sonunda parçalandıkları hücre merkezine doğru hareket eden stres lifi hareketlerini betimlemektedir. Chio grafiğinde stres lifleri, sitoplazmik alanda sürekli çizgiler şeklinde görünür ve genellikle hücre merkezine doğru aşağıya ve sağa doğru hareket ederler; liflerin orijinal chio grafiğinde görülmesinin zor olduğu durumlarda, unsharp mask filtresi görüntüyü netleştirir ve stres lifleri üzerine çizilen çizgiler, measure fonksiyonu kullanılarak piksel verilerinin toplanmasını kolaylaştırır. Alternatif olarak, tanımlanan stres lifinin başlangıcından sonuna kadar çizilen çizgiler, lifin gözlemlendiği süre boyunca kütle ortalama piksel verilerini sağlar.

Bu sunum, time-lapse görüntü setinden elde edilen verilerin Image J gibi yazılımlar kullanılarak grafik analizi yoluyla nasıl analiz edileceğini göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, transfekte edilmiş endotel hücrelerin canlı hücre görüntülemesini kullanarak, inflamatuar mediyatörlere yanıt olarak aktin hücre iskeleti dinamiklerinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.