Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Bu prosedürün genel amacı, dişi sıçan beyinlerinden elde edilen peel arteriyellerinin kesitlerini kullanarak östrojen reseptörü alfa'nın boyanmasını ve görselleştirilmesini optimize eden basit bir tekniği tanımlamaktır. Bu işlem, öncelikle Evan's blue boyası ile boyanmış peel arteriyellerinin beynin yüzeyinden çıkarılması ve kesim işleminden sonra bir kriyostat kullanılarak sekiz mikronluk halkalar şeklinde kesilmesiyle gerçekleştirilir. Enine kesitler lamlara monte edilir ve östrojen reseptörü alfa'ya karşı primer antikor ile inkübe edilir.

Ardından, kesitler ikincil antikor ve dpi içeren montaj medyumu kullanılarak karşı boyama ile inkübe edilir. Son olarak, floresan işaretli kabuk damar segmentleri görüntülenir ve genişletilmiş derinlik odaklama yazılımı kullanılarak 2D görüntülere dönüştürülür. Nihayetinde, genişletilmiş derinlik yazılımına sahip bir Nikon immunofloresan mikroskobu kullanılarak kabuk arteriyoler östrojen reseptör alfayı gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Ben Dr. Marguerite Littleton Kearney. Bugün, laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Dr. Neil Farani, östrojen reseptör alfa görselleştirmesini ve boyanmasını optimize etmek için basit bir prosedürü uygulamalı olarak gösterecek. Peel'de.

Evans blue boyası ile perfüze edilmiş ve -70 °C'de saklanmış bir sıçan beyninden arterlerin izole edilmesi. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak beyin yüzeyindeki pial arterleri belirleyin ve ince uçlu pensler yardımıyla bunları çıkarın. Yapışmış olan tüm beyin dokularını dikkatlice temizleyin.

Arterleri buz üzerinde küçük bir deney tüpüne yerleştirin. Arterleri 0,1 mole PBS içindeki %2 soğuk toz formaldehid ile 30 dakika boyunca fikse edin. Arterleri kesit almaya hazırlamak için, eksi 20 °C'ye ayarlanmış bir dondurma diskine gömme ortamı dökün.

Bir arter kesitini çuğ üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve donmasını bekleyin. Tamamen donduğunda, arteri kriyostat dondurma diskindeki gömme ortamına dik olarak yerleştirin. Arterin ucunun öne baktığından emin olun.

Arter, tamamen donana kadar cımbızla tutun. Arterin bulunduğu dondurma diskini kriyostat başına yerleştirin ve ardından sekiz mikron kalınlığında arteriyel halka kesitlerini doğrudan bir lam üzerine alın. Arteriyel kesitleri krom potasyum jelatine monte edin.

Arteriyel halkaları düzeltmek için iki fırça kullanarak lamları alt kısımlarından destekleyin. Hazırlanan lamları, bir lam kutusu içinde buzdolabında dört derece Celsius'ta gece boyunca saklayın. Lamları buzdolabından çıkarın ve tezgah üzerinde oda sıcaklığına getirin.

Lamları 1 ila 1,5 mililitre 0,1 molar PBS ile yıkayın. 10 dakika sonra PBS'yi süzün ve işlemi iki kez daha tekrarlayın. Son PBS yıkamasından sonra, lamları bir mililitre 50 milimolar amonyum klorür içinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Endojen floresan oluşumunu azaltmak için, daha önce açıklandığı gibi lamları 0,1 molar PBS ile 3 kez, her yıkama 10 dakika sürecek şekilde yıkayın. Ardından, primer antikorun spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için lamları %0,1 Triton X 100 ve %1 normal keçi serumu içeren bir PBS çözeltisinde 30 dakika boyunca bloklayın.

Bloklamadan sonra, slaytları bloklama solüsyonu içerisinde 1/500 konsantrasyonda seyreltilmiş ER alfa primer antikoru ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Slaytları buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına getirin. Bağlanmamış primer antikoru, 1 ila 1,5 mL 0,1% PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayarak uzaklaştırın.

Her seferinde, lamları bloklama solüsyonu içinde Oregon Green, 4 88 ikincil anti-tavşan antikoru ile oda sıcaklığında, karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin; inkübasyon sonrası lamları 0,1 molar PBS ile her yıkama 10 dakika sürecek şekilde 3 kez yıkayın ve ardından havalandırmalı çeker ocağa taşıyın. Lamların üzerine DAP içeren bir damla montaj medyumu damlatın ve ardından örneğin üzerine bir lam kapatma camı yerleştirin. Kapatma camının kenarlarını mühürlemek için şeffaf oje sürün ve tamamen kurumasını bekleyin.

Boyanmış damar segmentlerini içeren hazırlanan lamları mikroskobun altına yerleştirin ve floresan işaretli ilgi alanlarını görüntülemek için ayarlama yapın. Boyanmış ER alfa'nın görüntülenmesi, bu prosedürün en zor adımıdır. Reseptörlerin en net göründüğü damar kesit seviyesini bulun.

100 kat büyütme ile başlayın ve ardından büyütmeyi 600 kata çıkarın. Hücre çekirdekleri için DPI ve DR alfa için ZI kanallarında görüntüleri yakalamak üzere kamerayı kullanın ve ardından damar segmentlerinin birden fazla görünümünü 2D görüntülere dönüştürmek için yazılım kullanın. Burada, ER alfa için immünofloresan boyama sonuçları yeşil renkte ve DPI ile karşı boyama şeklinde gösterilmiştir.

Dişi sıçan beyninden izole edilmiş bir arter halkasındaki mavi renkte, birleştirilmiş görüntüler intranükleer östrojen reseptör alfa varlığını düşündürmektedir. Z-yığın görüntülerinin bir kombinasyonu kullanılarak, ER alfa immünofloresansının odaklanmış bir görüntüsü elde edilebilir; otofloresans değerlendirmesi için hem primer hem de sekonder antikor için negatif kontroller uygulanmalıdır. Sekonder antikor ile inkübe edilmemiş bir arterin endotel tarafı boyunca belirgin olan otofloresansa dikkat ediniz.

Bu videoyu izledikten sonra, beyin yüzeyinden arteryollerin nasıl izole edileceğini, soyulacağını ve sekiz mikronluk kesit halkalarının nasıl hazırlanacağını kavramış olmalısınız. Ek olarak, floresan işaretli östrojen reseptörü alfa ile çalışmaya ve dijital immunofloresan mikroskop ile Nikon extended yazılımını kullanarak reseptörleri nasıl görselleştireceğinize aşina olmalısınız.