Negatif Leke EM, Proteinler ve makromoleküler kompleksler görselleştirme: Izgara Hazırlık Image Acquisition

Bu prosedürün genel amacı, saflaştırılmış protein örneklerini negatif boyama elektron mikroskobisi ile görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle örneği destekleyecek olan elektron mikroskobisi ızgaralarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise negatif boyama solüsyonunun hazırlanmasıdır.

Ardından, numune elektron mikroskobu ızgarasına uygulanır ve negatif boyama yapılır. Son olarak, EM ızgarası bir elektron mikroskobuna yerleştirilir ve uygun optik koşullar altında görüntüler kaydedilir. Konvansiyonel parlak alan DEM görüntüleri, özelliksiz bir arka plan üzerine dağılmış tekil makromolekülleri gösteren, yüksek kontrastlı ve keskin ayrıntılı görüntülerdir.

Negatif boyama elektron mikroskopisi, favori proteininizi görüntülemek için basit bir yöntemdir. Saflaştırılmış proteininizi yapısal analiz veya diğer biyokimyasal ve biyofiziksel analizler için incelemek amacıyla rutin bir analiz olarak kullanılabilir. Burada, elektron mikroskopisi için negatif boyanmış bir örneğin nasıl hazırlanacağını gösteriyoruz.

Bazı adımların metin açıklamaları ve şekillerden öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi faydalıdır. Bir cam pipet kullanarak, geniş bir beherdeki suyun yüzeyine tek bir damla kollodyon damlatarak başlayın. Kollodyon yayılırken, su yüzeyindeki toz partiküllerini yakalayabilir.

Tozlanmış kollodyon plastik filmi kaldırın ve yerine yeni bir damla ekleyin. Ardından, 50 ile 100 arasında EM şebekesini, parlak yüzeyleri aşağı gelecek şekilde tek tek yüzen plastik filmin üzerine yerleştirin. Rutin negatif boyama için 400 mesh şebekeleri seçin ve 200 mesh şebekeleri seçin.

Eğim çifti görüntülerini toplamak için. Izgaraların alanından biraz daha büyük, kırışmamış ve yavaş emiciliğe sahip bir kağıt parçası seçin. Kağıdı ızgaraların üzerine yerleştirin ve kağıt tamamen ıslanana kadar bekleyin.

Kağıt suyu çok hızlı emmemelidir. Bunun için ucuz bir not defterinden kağıt kullanıyoruz. Izgaralar şu an plastik film ile kağıt arasında sandviç şeklinde yerleştirilmiştir.

Kağıdı bir Petri kabına yerleştirmek için bir pens kullanın ve yavaşça havada kurumasını bekleyin. Kırışıklıklara yol açabileceği için daha hızlı kurutma yöntemlerinden kaçının. Laboratuvarımızda kullanılan karbon kaplama makinesi, Creston 2 0 8 C yüksek vakumlu turbo karbon kaplayıcıdır.

Creston film kalınlığı monitörü ile donatılmıştır. Monitör, karbon birikintilerine karşı duyarlı bir kuvars balans kullanır. Ancak, burada açıklanan protokol bu cihazı gerektirmemektedir. Karbon kaplama makinesinde karbon çubukların sivriltilmesi ve yüklenmesiyle başlayın.

Sıradan bir sonraki adımda, buzlu alanın yarısı kaplanmayacak şekilde vakum gresi sürülmüş bir cam lam kaplanır. Karbon kaplama işleminden sonra, lamın gresli bölgeleri karbon kaplamanın kalınlığını tahmin etmek için kullanılır. Izgaralı kağıdı, karbon kaplama makinesinin çan kavanozu altındaki sahneye yerleştirin. Gresli camı konumlandırın.

Slaytı ızgaraların yanına kaydırın. Vakum odasını en az 10 micro tours değerine kadar pompalayın, aksi takdirde ark oluşumu ızgarada çok sayıda büyük parçacık oluşturacaktır. Şimdi akımı çok yavaş bir şekilde artırın.

Karbon çubuğun sivri ucu aşırı derecede parlak hale gelecektir. Kaplama başladığında buna çıplak gözle bakmayın; karbon kaplama biriktikçe cam lamın rengi koyu griye dönecektir, akımı istenen karbon kalınlığında kesin ve çan kavanozunun şeffaflığını göz önünde bulundurun. Bu değerlendirmeyi yaparken, lamın koyuluğu karbon kalınlığına göre kalibre edildiğinde, bu yöntem daha maliyetli olan film kalınlığı monitörü kadar doğru sonuçlar verir.

İşlem tamamlandığında, vakum odasının havasını tahliye edin ve kaplanmış ızgaraları daha sonra kullanmak üzere çıkarın. İnce plastik tabaka, negatif boyama görüntüsünün kalitesini etkilemeyecektir, ancak işleme devam etmeden önce ızgaralar birkaç saat kloroformda bekletilerek bu tabaka kaldırılabilir. Taze uranil format çözeltisi hazırlayın veya iki haftadan daha kısa süre boyunca karanlıkta saklanmış olan çözeltiyi kullanın.

Taze ve kaliteli bir çözelti sarı renktedir, pH değeri dört civarındadır ve çökelek içermez, oldukça temiz bir görünüme sahiptir. İşleme, ışıltılandırma (glow discharge) yapmak için ticari olarak temin edilebilen bir sistem kullanarak başlayın. Karbon kaplı ızgaraları deşarj edin.

Ardından, bir parça profil üzerine iki adet 20 µL saf su damlası ve iki adet 25 µL taze üriner format çözeltisi damlası yerleştirin. Ters kuvvetli antikapiler pens kullanarak, karbon kaplı tarafı yukarı gelecek şekilde glow discharge uygulanmış bir ızgarayı tutun. Kritik nokta, bu penslerin ızgaralardan sıvı sifonlamamasıdır.

Şimdi ızgaraya iki µL protein örneği uygulayın ve proteinlerin ızgara tarafından emilmesini bekleyin. Bu işlem genellikle 30 saniye sürer, ancak çok seyreltik örnekler daha fazla süre gerektirebilir ve bu durum tampon konsantrasyonlarını etkileyebilir. İşlem tamamlandığında, protein örneğini filtre kağıdı kullanarak kurulayın.

Ardından, ızgaranın yüzeyini kısaca bir su damlasına değdirip birkaç saniye içinde kurulayarak ızgarayı iki kez yıkayın. Suyla temasın ardından ızgarayı kısaca bir boya damlasına değdirin ve hızla kurulayın. Aynı tekniği kullanarak, ızgaranın ikinci bir boya damlasıyla 20 saniye boyunca temas etmesini sağlayın.

Son olarak, ızgarayı tezgah üstü çeker ocakta veya tercihen EM oturumundan önce vakumda hava ile kurutun; mevcutsa mükemmel bir hizalama dosyası yükleyerek EM mikroskobunun hizalamasını kontrol edin, bu işlem mikroskobu neredeyse mükemmel durumuna geri getirecektir. Şimdi EM ızgarasını tek eğimli standart bir numune tutucuya yerleştirin. Ardından, tutucuyu sahneye yerleştirin.

Ardından pompalama döngüsünün tamamlanmasını bekleyin ve tutucuyu kolona yerleştirin. Şimdi iyi boyanmış bir örnek alanı aramaya başlayın. Minimum kontrast yöntemini veya bir CC, D kamera kullanarak ve canlı dörtlü hesaplamayı yaparak manuel olarak odaklama yapın.

Güç spektrumunuzu belirleyin. Ardından derin odağı, genellikle -1,5 mikron olacak şekilde ihtiyaca göre ayarlayın. Boya konsantrasyonu ızgara boyunca farklılık gösterebilir, bu nedenle beyaz kontrastlı proteinleri arayın.

Protein kontrastının siyahlaştığı düzensiz boyanmış veya pozitif boyanmış alanlardan kaçının. Gridlerin hazırlanması ve negatif boyanan örneklerin görüntülenmesi için belirtilen yaklaşım kullanılmıştır. Gösterim amaçlı olarak birkaç yaygın protein görüntülenmiştir.

Detaylarına ve keskin kontrastına dikkat edin. Bu videoyu izledikten sonra, bir elektron mikroskobunda gözlemlemek üzere negatif boyanmış makromolekül örneklerinin nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem yaklaşık dört saatte tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, moleküler yapıları daha iyi anlamak için 3B yeniden yapılandırma gibi diğer yöntemler uygulanabilir.