Video-rate Tarama Konfokal Mikroskop ve Mikroendoskopi

Bu video, standart hazır bileşenler kullanılarak video hızında tarama yapan bir konfokal mikroskobun nasıl kurulacağını göstermektedir. Tarama yapan bir konfokal mikroskop, ışınını raster düzlemi boyunca kaydırmak için iki tarama aynasının koordineli hareketine dayanır; ilk aynadan gelen ışık, ilk röle lens seti boyunca yatay olarak taranır ve bu lensler ışığı ikinci tarama aynası üzerindeki sabit bir noktaya geri odaklar. Ardından aynı tarama hareketi, tarama ve tüp lensleri aracılığıyla aktarılarak, genişletilmiş ışık demeti objektif lensin arka diyaframına yerleştirilir.

Hareketi birinci aynaya kıyasla daha yavaş olan ikinci ayna, eş zamanlı olarak Y eksenini tarayarak gösterilen düzlemin üstünde ve altında tarama işlemi yapılmasına olanak tanır ve numune yüzeyinde dikdörtgen bir raster oluşturur. Bu protokolün ticari olarak mevcut bir mikroskop satın almaya göre temel avantajı, düşük maliyeti ve cihazın bir görüntüleme projesinin spesifik ihtiyaçlarına göre özelleştirilebilmesidir. Herhangi bir lazerle çalışırken, göze gelebilecek yaralanmaları önlemek için uygun güvenlik önlemlerinin alınması hayati önem taşır.

Mümkün olduğunca uygun lazer güvenlik gözlükleri taktığınızdan emin olun. Aktif olarak hizalama yapmayan veya ışınla çalışmayan izleyiciler ve/veya araştırmacılar her zaman gözlük takmalıdır. Parlak ve yansıtıcı tüm saatleri veya takıları çıkarın.

En önemlisi, bir ışın durağı veya sabitlenmiş bir kartvizit kullanarak ışının yolunu sonlandırarak, ışını her zaman takip ettiğinizden ve kontrol altında tuttuğunuzdan emin olun. Işının izlediği yolun tahmin edilmesi zor olabildiği için bu durum, aynaları hizalarken özellikle önemlidir. Ayrıca, gözlerinizi asla ışın yoluyla aynı seviyeye getirmeyin.

Mikroskobu monte etmeden önce lazer ışınının düzlemini geçmeniz gerekiyorsa lazeri kapatın. Optik ekmek tahtası (breadboard) ve 90 derecelik braketler, tüm aynalar, lensler ve dikroik aynanın yanı sıra uygun klempler ve montaj donanımları, her iki tarama aynası ve foto detektör dahil olmak üzere kurulum için gerekli tüm ekipmanların mevcut olduğundan emin olun. Hizalama sırasında tarama işlemini test etmek ve aynaları yönlendirmek için bir fonksiyon jeneratörünün el altında olması da faydalıdır.

Stabilite için optik ekmek tahtasının (breadboard) civatalarla sabitlenmesi de şiddetle önerilir. Mikroskobun kurulumuna, pigtail fiber adaptörü optik yuvaya yerleştirip bu düzeneği optik ekmek tahtasının ortasına konumlandırarak başlayın. Bu, burada gösterilen mavi ışının başlangıç noktasına karşılık gelir.

Işık kaynağını açın. Işının hem yatay hem de dikey olarak düz bir hat üzerinde ilerlemesini sağlamak için ayar vidalarını kullanarak kaba ayar yapın. Fiber kolimatörün önüne bir iris yerleştirin.

Ardından, ışının merkezden geçmesi için iris yüksekliğini ayarlayın. Daha sonra irisi, ışın yolu boyunca ator'dan uzağa taşıyın. Işın hizalamasını kontrol edin.

Gerekirse, ışını iris üzerinde yeniden konumlandırmak için iki ayar vidasını kullanın. Monte edilmiş diik aynayı, lazer ışını aynanın merkezinde olacak şekilde ışın yoluna yerleştirin. Işının yüksekliğinin değişmediğinden emin olarak, ışını yaklaşık 90 derece yansıtacak şekilde ayna tutucuyu döndürün.

Bağlantı aparatındaki vidaları sıkarak aynayı masaya sabitleyin. Ardından, monte edilmiş rezonans galvanometrik aynayı lazer ışın yoluna yerleştirin. Lazer ışınının, ayna yüzeyinin tam yatay merkezinde konumlandırıldığından emin olmaya dikkat edin.

Lazer ışınını 90 derecelik bir açıyla yansıtmak için ayna tutucuyu döndürün. Ardından, aynı lazer ışını dikey yüksekliğini korumak için aynadan gelen yansımayı kaba bir şekilde ayarlayın. Sonrasında, iki iris alın ve bunları doğrudan rezonans galvanometrenin önüne yerleştirin.

Ardından, rezonans gal aynasından yansıyan lazer ışınını referans alarak, dikey yüksekliklerini daha önce yapıldığı gibi ayarlayın. Şimdi, optik ekmek tahtası (breadboard) üzerindeki vida deliklerini kılavuz olarak kullanarak iki irisi düz bir hat üzerine sabitleyin. Işın yolundaki ilk ayna olan dikroik aynayı, ışını ilk irisin merkezine getirecek şekilde ayarlayın.

Ardından, yoldaki ikinci aynayı ayarlayın. Işını ikinci iris üzerinde merkezlemek için rezonans galvanometresini kullanın. Işın her iki iristen de hizalanana kadar bu iki aynayı yinelemeli olarak ayarlayın.

Rezonans gal aynasından yansıyan lazer ışınının hala yaklaşık olarak ayna merkezinden yansıdığından emin olun. Işın sapmışsa, fiber kollimatör tutucusunu ayarlayın ve ışın her iki açık irisin merkezindeyken ayarlamaları tekrarlayın. Bir sonraki adım, birinci sabit tele-sentrik düzlemi ikinci sabit tele-sentrik düzlem üzerine görüntüleyecek olan iki röle lensini yerleştirmektir.

Bu özel mikroskop için, ilk rölede seçilen mercekler aynı odak uzaklığına (F) sahiptir, dolayısıyla buradaki iki ayna arasındaki mesafe sadece dört F'dir. Bu düzenek için F, 90 milimetredir, bu nedenle dört F konumu tarama aynasından 360 milimetre uzaklıkta olacaktır. Merceklerin ışın yolu üzerinde tam olarak merkezlendiğinden emin olmak için ilk merceği ışın yoluna yerleştirin ve ışın yolundaki bir sonraki iriste lazer ışını noktasına bakın. Merceği yerleştirdikten sonra, ışının dikey merkezinin iris merkeziyle aynı olması için mercek yüksekliğini ayarlayın.

Ardından, ışını iris üzerinde ortalamak için yatay ışın konumunu ayarlayın. Bu işlemi ikinci lens ile tekrarlayın. Sonraki aşamada, tarama aynası kurulacak ve aksi takdirde dikey olarak ayarlanması gereken parçaların yerleştirilmesini ve hizalanmasını kolaylaştırmak için mikroskop döndürülecektir.

İkinci tele-sentrik düzlemin tam konumunu bulmak için, rezonant gal O'yu tarama ünitesine takın ve cihazı açın. Tarama ışınının iki mercek boyunca izlediği yolu takip etmek için bir kartvizit kullanın. İkinci tele-sentrik düzlem, rezonant gal O'dan yaklaşık dört F uzaklıkta yer alacak ve tarama ışınının sabit göründüğü konum olarak tanımlanabilecektir.

Bu konumun altındaki breadboard'u bir kurşun kalemle işaretleyin. Tele-sentrik düzlem belirlendikten sonra, tarama aynası girişini sıfır volta ayarlayın ve aynanın nötr konumuna yerleşmesi için ayna kontrol donanımına güç verin. Ardından, standart tarama galil aynasını tele düzlemin tam konumuna yerleştirin.

Tele düzlemindeki ışının tarama aynasının tam merkezine çarpacak şekilde ayna konumunu ayarlayın ve ayna tutucusunu sıkın. Şimdi gal aynasını tutan kilitleme vidasını gevşetip aynayı döndürün ve ışının dikey olarak yayıldığından emin olun. Ardından lazeri ve tarama elektroniğini kapatın.

Fiberi ve tarama aynalarını ayırın. Ardından 90 derecelik breadboard montaj braketlerini kullanarak ikinci breadboard'u birinciye sabitleyin.

Son olarak, yeni ekmek tahtası düz bir şekilde yatacak şekilde tüm mikroskobu dikkatlice döndürün ve mikroskobu konumunda sabitlemek için kelepçeyi kullanın. Galvo ve lazeri buraya tekrar bağlayın ve galvo'yu sıfır volta döndürmeyi unutmayın. Eski dikey düzeneğin geri kalan kısımları düz ekmek tahtası üzerinde kolayca gerçekleştirilebilir.

Ardından, resmi olarak tarama merceği ve tüp merceği olarak adlandırılan ikinci röle mercek setini kuracağız. Doğru mercek kombinasyonunu seçmeye ilişkin çok önemli bilgiler için lütfen ekteki yazılı protokole bakınız. Mercekleri kurarak başlayın.

İlk olarak, ışını objektif lensine yönlendirmek için gerekli olan aynaları yerleştirin. İlk büyük iki inçlik aynayı ekmek tahtasının (breadboard) kenarına yakın bir konuma yerleştirin ve lazer ışınını yaklaşık 90 derece yansıtacak şekilde ayna tutucuyu döndürün. Aynı dikey ışın yüksekliğini korumak için aynadaki yansımayı ayarlayın.

Ardından, ışını 90 derecelik bir açıyla yönlendirmek için diğer iki inçlik aynayı breadboard'un karşı kenarına yerleştirin ve sabitlemek için ayar vidalarını kullanın. Sonrasında, iki iris kurun ve ışını merkezlemek için iki aynayı daha önce yaptığınız gibi ayarlayın. Daha sonra, tarama lensini gal'den odak uzaklığı kadar mesafeye, ışın yolu üzerine yerleştirin ve yatay ile dikey konumunu ayarlayın.

Lazer noktasını iki ayna arasındaki ilk irise merkezlemek için; büyük iki inçlik tüp lensini tarama lensinden uygun mesafeye dikkatlice yerleştirin ve ışını ilk irise merkezlemek için yatay ve dikey konumunu ayarlayın. Bu düzende, tüm bileşenler yerleştirilmiş haldeyken tüp lensi 75 mm artı 300 mm mesafeye yerleştirilir.

gal O'yu standart bir elektriksel fonksiyon jeneratörünün veya kontrol devresinin çıkışına bağlayın ve tepe-tepe gerilimlerini bir ila üç volt olarak ayarlayın. Ardından, bir kartvizit kullanarak iki aynayı taramaya başlayın. Lazer ışınını, tüp lensinden 300 milimetre sonraki sabit düzlemde tespit edin.

Objektif merceği, arka açıklığının sabit düzleme mümkün olduğunca yakın konumlandırıldığından emin olarak ışın yoluna yerleştirin. Örnek tablasını, hareketli Z ekseni bağlantısının hareket aralığı boyunca ilerlerken objektif merceği bağlantısına çarpmayacağından emin olacak şekilde kurun. Konfokal düzeneği, pinhole ve dedektörü kurmak için öncelikle tüm güç kaynaklarını ve fiber optikleri ayırarak başlayın.

Mikroskop düzeneğini, rezonanslı tarama aynasını tutacak şekilde yeniden ekmek tahtası (breadboard) üzerine oturacak biçimde döndürün. Fiberi kolimatöre ve standart tarama aynasına, ardından güç, besleme ve kontrol kablolarına yeniden bağladıktan sonra, standart tarama galvosuna giden kontrol voltajını daha önce sahnede yaptığınız gibi sıfır volta ayarlayın ve iki lamel arasına sıkıştırılmış parlak bir boya örneği yerleştirin. Ardından lazer kaynağını açın ve boyayı odak noktasına getirin.

Bir kartvizit kullanarak, floresansın mümkün olduğunca parlak olması için lazer gücünü ayarlayın. Örnekten gelen floresan emisyonunu objektif mercekten ve tarama sisteminden geçerek, lazer ışınını yansıtan ancak floresan emisyonunu geçiren dikroik aynaya kadar takip edin. Bu floresan sinyalini dikroik aynanın diğer tarafında bulun.

Şimdi oda ışıklarını kısın. Emisyonu 90 derecelik bir açıyla yansıtmak için dikroik aynanın arkasına bir ayna yerleştirin. Ardından, aynalı bir iris kullanarak floresan ışınını ekmek tahtasına (breadboard) mümkün olduğunca düz ve paralel olacak şekilde yönlendirin.

Ardından, Thor Labs'ten alınan uzaysal filtre kafes montaj düzeneği kullanılarak konfokal pinhole ünitesi kurulacaktır. Bu diyagram kurulumu özetlemektedir. Tarama aynası, sabit bir objektif ile tele düzlemde yer alan sabit düzlemlerde bulunur.

Sabit düzlemler arasındaki arka açıklık düzlemi lens çiftleri, taranan ışınları iletme görevi görür. İlk lens çifti, bire bir teleskop oluşturan eşit odak uzaklığına sahip lenslerdir. Resmi olarak tarama lensi ve tüp lensi olarak bilinen ikinci lens çiftinin odak uzaklıklarının eşit olması gerekmez ve genellikle objektif arka açıklığının aşırı doldurulduğundan emin olmak için ışın genişletici bir teleskop görevi görürler.

Numuneden yayılan ışık, tarama sistemi üzerinden geri döner ve dikroik aynadan geçer. Kısa odaklı bir lens veya objektif lens, emisyon ışığını konfokal pinhole üzerinden odaklar ve ardından bu ışık bir lens tarafından kolime edilir. Son bir lens, konfokal filtrelenmiş emisyonu bir fotomultiplier tüp üzerine odaklar.

İlk odaklama lens yuvasını emisyon ışınına ortalmaya dikkat ederek, uzaysal filtre ünitesini emisyon ışını yoluyla aynı hizaya yerleştirin. Bu örnekte, 100 mikron iğne deliği boyutuna sahip bir uzaysal filtre ünitesi seçilmiştir. Ardından, üniteye kısa odak uzaklıklı bir lens monte edin ve iğne deliği yüzeyinde net bir odak gözlemlenene kadar Z translasyon yuvasını kaydırın.

Tüm ünitenin, floresan ışının belirlediği düz çizgi boyunca yönlendirildiğinden emin olun. Üniteyi optik masaya sabitleyin. Şimdi, translasyon tablasındaki ayar düğmelerini kullanarak, iğne deliği düzeneği yüzeyi üzerinde 2 boyutlu bir arama gerçekleştirmek için iki ekseni ayarlayın ve iğne deliğinden geçen floresan sinyalinin maksimum olduğu noktayı bulun.

Ardından, kaplama lensini iğne deliğinden sonraki kafes bağlantısına yerleştirin; bir kartvizit kullanarak konfokal üniteden geçen floresan iyonunu bulun ve yayılan floresans mümkün olduğunca toplandığında kaplama lensini destekler boyunca kaydırın. Fotomultiplier tüp düzeneğini kurun. Floresan emisyon ışın yolu üzerine 50 milimetre odak uzaklıklı bir lens yerleştirin ve odak noktasını belirleyin.

Breadboard üzerindeki bu konumu işaretleyin. Şimdi lazeri tamamen kapatın ve fotomultiplier tüpün penceresi işaretli odak noktasına mümkün olduğunca yakın olacak şekilde konumlandırın. Ardından, ayarlanabilir lens tüplerini kullanarak düzeneği odaklama lensine bağlayın.

Pinhole'dan sonraki tüm açık ışın yollarını siyah bantla sarın, lazerin gücünü son derece düşük tutarak lazeri açın. Osiloskop üzerinden voltajını dikkatlice okuyarak fotomultiplier tüpü açın. Lazer şiddeti artırıldıkça, osiloskop ekranında spike benzeri bir okuma ve/veya bir DC ofset görülene kadar voltajı artırın.

Lazer gücünü kapatarak veya sinyal kaybını gözlemlemek için ışın yolunu engelleyerek, bu sinyalin gerçekten floresanstan kaynaklandığını doğrulayın. Son olarak, osiloskopta maksimum sinyal elde etmek için iğne deliğini (pinhole) iteratif olarak hizalayın. Önce odaklama merceğinin Z konumunu manipüle edip ardından YZ translasyon tablasını ayarlayarak, video hızındaki mikroskop donanımı tamamlanmış olur.

İlk olarak, fotomultiplier tüpü kapatın. Şimdi aynaların özel kontrol kartlarını ve bilgisayarı ekteki yazılı protokolde gösterildiği şekilde bağlayın. Bu sistem, konfokal taramalı mikro endoskopi yapmak için uyarlanabilir.

Sahnenin bir fiber tutucu sahne ile değiştirilmesi için lütfen beraberindeki metne veya detaylara bakınız. Tamamlanmış dik konfokal tarama mikroskobu ve mikro endoskop burada gösterildiği gibi görünmelidir. Lazer ve emisyon ışınları, gözle takip edilebilmesi için kılavuz olarak çizilmiştir.

Mikro endoskopi işlemi sırasında, bir fiber tutucu, deneyler için görüntü fiberini sabit tutar. Bu fiber tutucu, kullanım amaçlarına göre kolaylıkla bir XY tablası ile değiştirilebilir. Burada gösterilen dik mikroskop platformu, gelen sinyalden görüntüler oluşturmak için bir video hızında kare yakalama kartı kullanılarak beyaz bir kartvizit üzerine basılmış küçük harf M'den alınan temsili bir test görüntüsüdür.Ağartılmış.

Beyaz kağıt, UV ve mavi ışıkla kolayca uyarılabilen ve karanlığın arkasında parlak bir arka plan oluşmasına neden olan floroforlar içerir. Bu floresan emisyonu toplamak için M harfi ve 515 nanometre merkezli emisyon filtresi seçilmiştir. Özellikle görüntü çerçevesinin yan kenarları yakınında görüntüde küçük bir bozulma gözlemlenebilir.

Bu distorsiyon, sekiz kilohertz gvo aynasının sinüzoidal tarama deseninden kaynaklanmaktadır ve beraberindeki belgede ayrıntılı olarak ele alınmıştır. Bu video, bir kartvizitin taranmasıyla elde edilen örnek video hızındaki verileri göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, video hızında bir konfokal tarama mikroskobunun nasıl kurulacağı ve hizalanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Lazer ışığıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken tüm yansıtıcı takıların çıkarılması ve gözlerin ışın hattıyla aynı seviyede tutulmaması gibi önlemler her zaman alınmalıdır.