Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Geleneksel olarak, hücresel düzeyde çözünürlükte mikroskobik analiz gerektiren biyolojik ve klinik çalışmalar, örneklerin ışık mikroskopuyla değerlendirilmek üzere ardışık zaman noktalarında çalışmadan çıkarıldığı ve birden fazla deneyin paralel olarak yürütüldüğü yöntemlerle gerçekleştirilmiştir; konfokal, çok fotonlu ve ikinci harmonik mikroskopi ise in situ görüntüleme için yararlı tekniklerdir. Gereken altyapı, tarama lazer sistemleri ve karmaşık ışık kaynaklarını içeren, karmaşık ve pahalı bir yapıdadır. Burada, 5.000 ABD doların altında bir maliyetle, hazır bileşenler kullanarak tek bir günde yüksek çözünürlüklü bir fiber optik mikro endoskop sisteminin nasıl kurulacağını gösteriyoruz.

Platform; görüntü çözünürlüğü, görüş alanı ve çalışma dalga boyu açısından esneklik sunar. İlk olarak, bir ışık kaynağını, optik filtreleri, lensleri, bir fiber optik demetini ve bir CCD kamerayı barındırmak üzere basit bir epi floresan mikroskop iskeleti kurulur. Ardından, fiber optik demetinin CCD kamera üzerinde büyütülmüş bir görüntüsünü oluşturan görüntüleme lensleri monte edilir.

Numuneye floresan eksitasyon ışığı sağlamak amacıyla, ardından aydınlatma optikleriyle birlikte bir LED kaynağı kurulur. Son olarak, monte edilmiş mikro endoskop ile gerçekleştirilen gerçek zamanlı görüntüleme; in vitro kültürler, in vivo hayvan modelleri ve insan denekler dahil olmak üzere floresanla işaretlenmiş numunelerin hücresel düzeydeki ayrıntılarını ortaya çıkarır. Bu tekniğin konfokal veya çok fotonlu mikroskopi gibi mevcut yöntemlere kıyasla temel avantajı, yeterince basit ve düşük maliyetli olması sayesinde farklı alanlarda çalışan araştırmacıların tekniği hızla uygulayabilmeleri ve kendi özel ihtiyaçlarına göre özelleştirebilmeleridir.

Burada açıklanan yüksek çözünürlüklü mikro endoskop, montaj ve uygulamada çeşitli varyasyonlara izin veren bir temel konfigürasyon olarak değerlendirilmelidir. Belirli bir uygulama için bileşen seçerken; florofor konsantrasyonu, fotobezme aydınlatması, şiddeti, kamera hassasiyeti, kazanç ve pozlama süresi arasında floresan mikroskobisine özgü olan ilişkileri göz önünde bulundurun. Bu platform, floresan kontrast maddesi olarak proflavin ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ancak diğer floresan boyalarla çalışacak şekilde konfigüre edilebilir.

Pro flavin, sırasıyla 445 nanometre ve 515 nanometre pik absorbsiyon ve emisyon dalga boylarına sahip parlak bir çekirdek boyasıdır. Diğer kontrast ajanlarının kullanımı, mikro endoskop sistemini kurmak için kullanıcının uyarım emisyon ve dikroik filtreleri uygun şekilde seçmesini gerektirecektir. İki adet 6 inçlik kafes çubuğunu iki adet 1,5 inçlik kafes çubuğuna bağlayarak 7,5 inç uzunluğunda bir çift çubuk oluşturarak başlayın. Çubukları katlanır ayna ünitesinin bir yüzüne vidalayın, ardından bir inç çapında bir ayna takın.

Ardından, katlanır ayna ünitesinin karşı yüzüne dört adet 0,5 inçlik çubuk vidalayın. Kafes küpünü, iki alt geçiş deliği aracılığıyla 7,5 inçlik kafes çubuklarının üzerine kaydırın. İki inçlik çubukları kafes küpünün yan yüzüne vidalayın.

C mount'tan SM1'e dönüştürücü bir adaptör kullanarak kamerayı bir kafes plakasına takın. Kafes plakasını, katlanır ayna ünitesinin yüzeyiyle aynı hizada olacak şekilde 0,5 inçlik kafes çubuklarına sabitleyin. Fiber optik demetin görüntüsünü kamera üzerinde oluşturmak için bir inç çapında bir tüp lens seçin.

Lensin odak uzaklığı, fiber optik demetin nedeninin en az iki piksel tarafından örneklenmesini sağlayacak şekilde seçilmelidir. Kameraya görüntüleme yapıldığında, lensi üç inç uzunluğundaki bir lens tüpüne yerleştirin ve lensi bir sabitleme halkasıyla sabitleyin. Sabitleme halkalarının uzun lens tüplerine vidalanması için bir kurbağacık anahtar kullanılması faydalıdır.

Emisyon filtresini üç inçlik lens tüpünün içine, ilk sabitleme halkasının üzerine yerleştirin ve filtreyi sabitlemek için başka bir halka daha ekleyin. Filtre yönleminin, filtre üreticisi tarafından belirtilen standartlara uygun olduğundan emin olun. Lens tüpünü, kafes kübün CCD kameraya en yakın olan yan kısmına vidalayın.

Bu konum burada da gösterilmiştir. Diyagramda, bu lens ve filtrenin üç inçlik lens tüpü olmadan gösterildiğine dikkat ediniz. Netlik sağlamak için kamerayı bir bilgisayara bağlayın ve görüntüyü ekrandan izleyin.

Kafes düzeneğini uzak bir nesneye yöneltin ve nesnenin görüntüsü netleşene kadar kafes küpünü raylar boyunca kaydırın. Kafes küpünün yanlarında bulunan dört vidayı sıkmak için bir tornavida kullanın. Bu vidalar sıkıldığında rayları kavrayarak küpü konumunda sabitler.

Bu, tüp lenslerin, sonsuzluk düzeltmeli objektif lens ile birleştirildiğinde kamera üzerinde fiber demetin odaklanmış bir görüntüsünü oluşturmasını sağlayacaktır. Ardından, diyik aynasını tutucuya yerleştirin ve kafes küp içinde 45 derecelik açıya konumlandırın. Objektif lensi, bir RMS - SM1 diş adaptörü ve ayarlanabilir bir lens tüpü aracılığıyla, kafes küpün tüp lens tutucusunun karşı tarafındaki yüzüne vidalayın.

Ardından, bir kafes plakasına SMA konnektörü vidalayın ve bunu objektif lensin çalışma mesafesine yaklaşık olarak denk gelecek şekilde çubuklara monte edin. Kafes kübünün açık kenarlarına taban plakasını ve uç kapağını ekleyin. Daha sonra, bir LED'i kafes plakasına monte edin ve onu iki inçlik çubukların ucuna kaydırarak yerleştirin.

Lens tüpünün yan tarafı kafes kübe vidalandığında, objektif lensin arka açıklığını dolduran bir LED görüntüsü oluşturacak şekilde 0,5 inçlik bir lens tüpüne bir lens ekleyin. Ayrıca, eksitasyon filtresini lens tüpüne yerleştirin. Bu aşamada, epoksi kullanarak aydınlatma ışık yoğunluğunu kontrol etmek için bir LED sürücüsü kullanılabilir.

1030 mikronluk bir fiber için olan SMA konnektörü, 720 mikron görüş alanı fiber optik demetine takın. Fiber optik konnektörleme hakkında ayrıntılar için T Thor labs, parça numarası FN doksan altı, "Optik fiberlerin konnektörlenmesi ve cilalanmasına yönelik bir kılavuz" kaynağına başvurun.

SMA konnektör göz demetini, kafes çubuklarına monte edilmiş SMA yuvasına vidalayın. Demetin distal ucunu geniş bantlı bir ışık kaynağına doğru yönlendirin; floresan aydınlatma yeterli olacaktır. Ardından, demetin proksimal yüzünün görüntüsünü CCD kameradan gözlemleyin. Son olarak, objektif lensin konumunu kafes küpüne vidalayarak veya gevşeterek ayarlayın.

Fiber demeti görüntüsü netleşene kadar, bireysel neden açıkça görünür olmalıdır. Mikro endoskopun uzaysal çözünürlüğü, fiber demetinin distal ucuna bir mikro lens veya lens düzeneği ekleyerek artırılabilir. Bu optikler, demet ucunun doğrudan doku üzerine yerleştirilmesi yerine, ucun düşük büyütme ile doku yüzeyine görüntülenmesi şeklinde yapılandırılmıştır.

Böylece fiber demetin ışık iletiminden kaynaklanan uzamsal örnekleme frekansını artırın. DEM büyütme derecesi, uzamsal çözünürlükteki artışa ve aynı zamanda görüş alanındaki orantılı bir azalmaya karşılık gelir. Uygulamanız için istenen büyütme ve çalışma mesafesine sahip bir GRIN lens seçin.

Lens çapının, birlikte çalışmayı planladığınız fiber demetinin çapıyla eşleştiğinden emin olun. Hassas hizalama için fiber demetini ve GRIN lensi, düşük büyütmeli bir mikroskop veya stereoskop altında, ayrı üç eksenli manuel konumlandırma tablalarına monte edin.

Ardından, lensin veya demet yüzeyinin üzerine bir damla optik yapıştırıcı yerleştirin. Manuel konumlandırıcıları kullanarak, iki bileşeni birbiriyle temas ettirin. Yapıştırıcıyı kürlemek için arayüzü, üretici tarafından önerilen dozda UV ışığına maruz bırakın.

Gradyan indeksli (grin) lensi ve yapışma ara yüzeyini korumak için, eklemi çevrelemek üzere kısa bir alüminyum kapiler tüp kullanın. Tüpü eklemin üzerine kaydırın ve tüpün her iki ucuna bir damla epoksi sürerek sabitleyin; montajı tamamlamak için ısı ile daralan makaron kullanın. Mikro endoskopik görüntülemeden önce, hücreleri ve kültürleri görüntülemek için görüntülenecek hücrelere veya dokuya kontrast madde uygulayın.

Öncelikle, büyüme ortamı pipetle uzaklaştırılır. Ardından, pro flavin çözeltisi kuyucuğa nazikçe pipetle eklenir. Bir dakikaya kadar süren kısa bir inkübasyonun ardından, pro flavin çözeltisi pipetle uzaklaştırılır ve atılır.

Kuyucuğa taze PBS çözeltisi ekleyip uzaklaştırarak hücreleri durulayın; stabilite için fiber demetinin distal ucunu, x, Y, Z eksenlerinde manuel konumlandırma aşamalarına sahip güvenli bir fikstüre yerleştirin. Boyanın hücrelere veya dokuya uygulanmasını takiben görüntüleme sırasında, fiber optik demeti numune ile hafif temasa gelecek şekilde yerleştirin. Fiber optik demetin görüntüsünü, kamera üreticisi tarafından sağlanan yazılımı veya geliştirmek isteyebileceğiniz herhangi bir özel yazılımı kullanarak bilgisayar ekranından görüntüleyin.

Kabul edilebilir parlaklıkta bir görüntü elde etmek için kameranın pozlama süresi ve kazanç ayarlarını düzenleyin. Doğru şekilde monte edildiğinde, mikro endoskop, koherent bir fiber optik demet aracılığıyla aktarılan bir epi-floresan mikroskop gibi çalışacaktır. En iyi görüntüleme sonuçları için üç temel koşulun karşılandığından emin olunmalıdır.

Öncelikle, sistemin tam çözünürlüğüne ulaşmak için fiber demetinin proksimal yüzü, odak kayması olmadan CCD kameraya yansıtılmalıdır. Burada, bir fiber demetinin bir bölümü kötü odaklama, hafif odaklama ve iyi odaklama ile görüntülenmiştir. Optimum odaklama, objektif lensin demet yüzüne göre gerçek konumunun ayarlanmasıyla bulunur.

İkinci olarak, fiber demetinin proksimal yüzü tüm çapı boyunca homojen bir şekilde aydınlatılmalıdır. Daha önce açıklandığı üzere, bu durum aydınlatma optiklerinin kolimasyonlu aydınlatma için yapılandırılmasıyla sağlanır. Burada gösterilen görüntü, homojen bir floresan numunenin bu tercih edilen yapılandırmada aydınlatılmasıyla elde edilmiştir.

Kritik aydınlatma altındaki karşılık gelen sonuç burada gösterilmiştir. LED'in yapısı fiber demet yüzeyine görüntülenmekte ve bu durum, gerçek numune yapısının üzerine binen istenmeyen bu desenin oluşmasına yol açmaktadır. Üçüncü olarak, fiber demetin hem proksimal hem de distal yüzeylerinin temiz olduğundan, çizik ve kırıklardan arındırıldığından emin olmak önemlidir.

Bu örnekte, demet yüzeyine görüntü kalıntıları yapışmış durumdadır ve fiber çevresinde saat beş yönünde küçük bir kırık şeklinde hasar görülmektedir. Kalıntılar, lens kağıdı ve izopropanol veya standart fiber optik temizleme araçları kullanılarak, geleneksel fiber optik konnektörlerle aynı şekilde temizlenerek demet yüzeylerinden uzaklaştırılabilir. 1483 hücre pro flavin ile işaretlenmiş ve çıplak fiber demeti numunenin üzerine hafifçe yerleştirilmiştir.

Bir 2,5 x grin lensin demet ucuna bağlanmasıyla elde edilen in vitro görüntüleme burada gösterilmektedir; bu işlemle uzaysal çözünürlükte bir iyileşme ve görüş alanında bir daralma sağlanmıştır. Bu videoda görüldüğü üzere, 0,5 milimetre dış çapa sahip bir fiber demetin 21 gauge iğneden geçirilip bir fare meme yağ pedi dokusuna ilerletildiği in vivo görüntüleme gerçekleştirilmiştir; adipositler, kardiyak döngü kaynaklı hareketle birlikte net bir şekilde görülmektedir. Bu örnekte, 1,5 milimetre dış çapa sahip daha büyük bir fiber demet kullanılarak sağlıklı bir insan gönüllüsünün oral mukozasının görüntülemesi yapılmıştır.

Tüm örneklerde, gösterilen pro flavin nükleer işaretleme floresan kontrast maddesi olarak kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin ve dokuların in C iki floresan görüntülemesi için bir fiber optik mikro endoskopun nasıl tasarlanacağı ve monte edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.