Kan örneklerinden Bakteriyel Patojen Algılama ve Antimikrobiyal Direnç Testi için bir günlük iş akışı şeması

Bu prosedürün genel amacı, kan kültürü izolatlarının antibiyotik duyarlılığını geleneksel yöntemlerden daha kısa sürede tanımlamak ve değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle yeni bir 16 s ribozomal DNA MultiPro PCR testi kullanılarak kan kültürü izolatının tanımlanmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından izolat, bir dizi antibiyotikle altı saat boyunca inkübe edilir. Bir sonraki adım, kantitatif 16 s ribozomal D-N-A-P-C-R analizi kullanarak, antibiyotiğin varlığında izolatın büyüme durumunu veya büyüme inhibisyonunu belirlemektir. Sonuçlar, bir kan kültürü izolatının tanımlanmasının ve antibiyotik duyarlılık testinin, kültür ve PCR kombinasyonu aracılığıyla daha hızlı bir şekilde elde edilebileceğini göstermektedir.

Bu tekniğin, otomatik phoenix veya IIC sistemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, önceden kültürleme durumunun gerekmemesi ve tanımlama ile antibiyotik duyarlılık testi sonuçlarının aynı gün içinde alınabilmesidir. Prosedürü laboratuvarımızdan PhD öğrencileri Vandy Hanson ve GID gösterecektir. Mikrobiyal büyüme için pozitif olan 100 µL kan kültürünü, 900 µL %0,9 sodyum klorür içeren bir reaksiyon tüpünde seyreltin. Ardından, bakterileri çöktürmek için numuneyi 13.400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Reese, peleti 100 µL steril demiyeralize su içerisinde süspande et. Örneği, daha sonra kullanana kadar dört °C'de muhafaza et. Tüm örnekler hazır olduğunda, ilgili bakterilerin spesifik 16 s ribosomal DNA'sını amplifiye etmek için real-time PCR reaksiyon karışımlarını hazırla.

Reaksiyon başına hacimleri 20 microliters'a ayarlamak için demisterilize su kullanın. 96 kuyucuklu bir PCR plakasındaki her kuyucuğa 20 microliters PCR karışımı paylaştırın. Ardından her kuyucuğa beş microliters numune ekleyin ve PCR plakasını kapatın.

Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'ı ABI Prism 7, 900 HT gerçek zamanlı PCR sisteminde çalıştırın; PCR tamamlandığında önce analiz ayarları sekmesini kullanarak CT analizini 0,1 olarak ayarlayın. Daha sonra baseline yapılandırmalarını altıncı döngüde başlayacak ve 15. döngüde bitecek şekilde daraltın. Her örnek için CT değerini kaydedin.

Bir PCR sonucunu pozitif kabul etmek için eşik değer genellikle 35 CT değeri olarak belirlenebilir. Bu örnekte, E. coli ile enfekte olmuş bir kan kültürünün tanımlama profili iki reaksiyon karışımında gösterilmiştir. Evrensel 16s ribozomal DNA primerleri kullanılmış ve sırasıyla 25,2 ve 25,95 CT değerlerinde iki amplifikasyon eğrisi oluşturulmuştur.

Üçüncü amplifikasyon eğrisi Coli'ye özgü probdan elde edilmiştir. Diğer spesifik problar tespit edilebilir sinyaller üretmemiştir. Patojen tanımlandıktan sonra antibiyotik testi gerçekleştirilebilir.

İşleme, pozitif bir kan kültüründen beş mililitre kan kültürleme ortamını bir serum separatör tüpüne aktararak başlayın. Numuneyi 2000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından tüpteki üst fazı atın. Daha sonra, steril bir pamuklu çubuk kullanarak, tüpün jel tabakasındaki bakterileri, 0.5 McFarland standardı bulanıklığında bir çözelti elde edilene kadar %0,9 sodyum klorür içerisine aktarın.

Bu, mililitre başına yaklaşık 1,5 × 10⁸ koloni oluşturan birime karşılık gelir. Ardından, yaklaşık 5 × 10⁵ koloni oluşturan birim/ml konsantrasyonu elde etmek için süspansiyonu çift konsantrasyonlu Muller Hinton buyonunda seyreltin.

Antibiyotik seçimlerinin her kuyucukta 50 µL bulunduğu bir mikrotitrasyon plağındaki her kuyucuğa, süspansiyondan 50 µL paylaştırın. Antibiyotikler yerine su içeren kuyucukları kullanarak her örnek için pozitif büyüme kontrolleri eklediğinizden emin olun. İşlem bittiğinde plağın üzerini kapatın.

Ardından, bakteriyel büyümeye olanak sağlamak için plakayı 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. Negatif büyüme kontrolü olarak bakteriyel süspansiyondan bir alikotu 4 °C'de sakladığınızdan emin olun. Altı saatlik inkübasyonun ardından, her kuyucuğun içeriğini ve negatif kontrol örneğini ayrı steril tüplere aktarın.

16.000 ×g'de beş dakikalık santrifüj işleminin ardından, 80 µL süpernatantı uzaklaştırın ve peletleri 80 µL steril demineralize su içerisinde yeniden süspande edin. Örnekleri, 16S ribozomal DNA real-time PCR için kullanmadan önce su ile 1/10 oranında seyreltin.

IQ cyber green super mix ve 16 s ribozomal DNA primerlerini kullanarak PCR karışımını hazırlayın ve 96 kuyucuklu bir PCR plakasına kuyucuk başına 20 µL olacak şekilde paylaştırın. Ardından, her bir örnekten 5 µL'yi kuyucuklara ekleyin ve plağı mühürleyin.

Ardından, sonuçları analiz etmek için PCR'yi çalıştırın. İlk olarak, cutoff CT değerini hesaplayın. Genel olarak, cutoff CT değeri, pozitif büyüme kontrolünün CT değeri artı negatif büyüme kontrolünün CT değerinin 0,5 katı eksi büyüme kontrolünün CT değerine eşittir.

Bununla birlikte, gram-negatif basilere karşı piperasilin tazobaktam ve seftazidim ile staphylococcus aureus'a karşı amoksasilin, oksasilin ve trimetoprim sülfametoksazol veya enterococcus SPP'de amoksasilin için 0,5 olan multiplikasyon faktörü 0,25'e düşürülmelidir. Her örnekteki suşların duyarlılığı veya direnci, örneğin CT değeri ile cutoff ct değeri karşılaştırılarak belirlenebilir.

Kesme değerinin üzerindeki bir CT değeri duyarlılığı, kesme değerinin altındaki bir CT değeri ise direnci gösterir. Burada, bir antibiyotik duyarlılık amplifikasyon grafiği örneği verilmiştir. Daha önce tanımlanan E. coli suşu, her biri ayrı bir eğri ile temsil edilen birkaç antibiyotiğe karşı duyarlılık açısından test edilmiştir.

Düşük CT değerine sahip örnekler, test edilen antibiyotiğe karşı direncin olduğunu gösteren, antibiyotik varlığında büyümenin gerçekleştiği örneklerdir. Buna karşılık, yüksek CT değeri, test edilen antibiyotiğe duyarlılığın olduğunu gösteren, büyümenin gerçekleşmediği bir örneği temsil eder. Bu teknik, yeterince uzmanlaşıldığında ve doğru şekilde uygulandığında dokuz saat içinde tamamlanabilir.